Повышенный уровень «плохого» холестерина в крови — одна из главных причин атеросклероза, инфаркта и инсульта. Обычно его снижают таблетками, которые нужно принимать всю жизнь. Но в 2020-х годах начались испытания другого подхода: однократно изменить в клетках печени один ген — PCSK9 — так, чтобы уровень холестерина снизился навсегда. История этого гена — от наблюдения за редкими семьями до редактирования генома в организме человека — хорошо показывает, как медицинская генетика превращается в лечение. В статье разобраны обмен холестерина, роль белка PCSK9, природные мутации, лекарства и устройство генных редакторов, которые применяют в испытаниях.
- 1. Холестерин и липопротеины
- 2. Рецептор ЛПНП
- 3. Что делает белок PCSK9
- 4. Природные мутации — подсказка для медицины
- 5. Лекарства против PCSK9
- 6. Редактор оснований
- 7. Испытания на людях
- 8. Риски и вопросы
- 9. Для олимпиад
- Задания с разбором
1. Холестерин и липопротеины
Холестерин — стероид, необходимый организму: он входит в состав мембран клеток животных, служит исходным веществом для синтеза стероидных гормонов (половых, гормонов коры надпочечников), желчных кислот и витамина D. Около 80 % холестерина синтезирует сам организм, в основном печень, остальное поступает с пищей.
Холестерин нерастворим в воде и переносится кровью в составе липопротеинов — частиц, у которых снаружи слой фосфолипидов и белков, а внутри — холестерин и жиры.
- Липопротеины низкой плотности (ЛПНП) переносят холестерин от печени к тканям. При избытке ЛПНП холестерин откладывается в стенках артерий, образуя атеросклеротические бляшки. Поэтому холестерин ЛПНП называют «плохим».
- Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) переносят избыток холестерина от тканей в печень («хороший» холестерин).
2. Рецептор ЛПНП
Главный способ удаления ЛПНП из крови — их захват клетками печени. На поверхности клеток печени есть белки — рецепторы ЛПНП. Рецептор связывает частицу ЛПНП, и участок мембраны вместе с ними впячивается внутрь клетки — происходит рецептор-опосредованный эндоцитоз. В клетке частица ЛПНП отделяется от рецептора и разрушается в лизосоме, а рецептор возвращается на поверхность. Один рецептор совершает такой цикл более ста раз.
Этот механизм открыли Майкл Браун и Джозеф Голдстайн (Нобелевская премия 1985 года), изучая больных семейной гиперхолестеринемией — наследственным заболеванием, при котором из-за мутации гена рецептора ЛПНП холестерин в крови повышен с рождения, а инфаркт может случиться в молодом возрасте.
Чем больше рецепторов на клетках печени, тем быстрее ЛПНП уходят из крови и тем ниже уровень «плохого» холестерина.
3. Что делает белок PCSK9
В 2003 году канадские и французские исследователи (Набиль Сейда, Марианна Абифадель и соавторы) обнаружили в семьях с гиперхолестеринемией мутации не в гене рецептора, а в гене белка PCSK9. Его функция оказалась такой:
- PCSK9 синтезируется клетками печени и выделяется в кровь.
- Он связывается с рецептором ЛПНП на поверхности клетки.
- Рецептор вместе с PCSK9 захватывается внутрь, но не возвращается на поверхность, а разрушается в лизосоме.
- Рецепторов становится меньше, ЛПНП медленнее удаляются, и холестерин в крови повышается.
Мутации, усиливающие работу PCSK9, вызывают гиперхолестеринемию. Значит, ослабление PCSK9 должно снижать холестерин.
4. Природные мутации — подсказка для медицины
В 2005–2006 годах Джонатан Коэн и Хелен Хоббс, изучая тысячи жителей Далласа, нашли людей с мутациями, выключающими ген PCSK9 (нонсенс-мутации — замены, превращающие кодон аминокислоты в стоп-кодон). У носителей одной такой мутации:
- уровень холестерина ЛПНП был примерно на 28 % ниже;
- риск ишемической болезни сердца за 15 лет — на 88 % ниже;
- никаких вредных последствий не обнаружили.
Позже нашли женщину, у которой обе копии гена не работали: белка PCSK9 у неё не было совсем, уровень холестерина ЛПНП был очень низким, а сама она была здорова и родила детей. Это важнейший довод: если люди живут без PCSK9 без вреда, то выключение этого гена у пациентов, вероятно, безопасно. Такие люди — «естественный эксперимент», подсказывающий мишени для лекарств.
5. Лекарства против PCSK9
| Подход | Как действует | Как применяют |
|---|---|---|
| Статины | Подавляют синтез холестерина в печени; клетки в ответ образуют больше рецепторов ЛПНП | Таблетки ежедневно |
| Моноклональные антитела к PCSK9 | Связывают PCSK9 в крови и не дают ему соединиться с рецептором | Инъекции раз в 2–4 недели; ЛПНП снижается примерно на 60 % |
| Малая интерферирующая РНК (инклисиран) | Разрушает мРНК PCSK9 в клетках печени — белок не синтезируется | Инъекции раз в полгода |
| Редактирование гена | Однократно выключает ген PCSK9 в клетках печени | Одна инфузия (на стадии испытаний) |
Все эти подходы, кроме редактирования, требуют постоянного применения. Многие пациенты бросают лечение, и холестерин снова растёт. Отсюда идея — изменить ген один раз.
6. Редактор оснований
Обычная система CRISPR-Cas9 разрезает обе цепи ДНК, а ген выключается за счёт ошибок при восстановлении разрыва (см. статью «CRISPR-Cas9»). Но двухцепочечные разрывы опасны: в клетке возможны крупные перестройки хромосом. Поэтому для гена PCSK9 используют более аккуратный инструмент — редактор оснований, разработанный в лаборатории Дэвида Лю (2016–2017).
- Белок Cas9 изменён так, что разрезает только одну цепь ДНК (никаза).
- К нему присоединён фермент дезаминаза, полученный методом направленной эволюции (см. статью «Направленная эволюция»). Он превращает аденин в инозин, который при репликации и репарации читается как гуанин.
- Направляющая РНК приводит комплекс к нужному участку гена; в узком «окне» в несколько нуклеотидов пара А — Т превращается в пару Г — Ц.
Для PCSK9 выбрали замену одного нуклеотида в месте сплайсинга — на границе экзона и интрона. После замены сплайсинг нарушается, мРНК созревает неправильно, и работающий белок не синтезируется. Ген выключен без разреза обеих цепей ДНК.
Доставка в печень
Пациенту внутривенно вводят мРНК редактора и направляющую РНК, упакованные в липидные наночастицы — те же, что в мРНК-вакцинах. Такие частицы в крови покрываются белком-аполипопротеином и захватываются клетками печени через… рецепторы ЛПНП. В клетке с мРНК синтезируется белок-редактор, изменяет ген и через несколько дней разрушается. Изменение ДНК остаётся в клетках печени навсегда и передаётся дочерним клеткам при их делении.
7. Испытания на людях
- 2021 год. Группа Кирана Мусунуру и компания Verve показали на обезьянах: одна инфузия редактора снизила уровень PCSK9 в крови примерно на 90 %, холестерин ЛПНП — примерно на 60 %, и эффект сохранялся месяцами.
- 2022–2023 годы. Первые испытания на пациентах с семейной гиперхолестеринемией: при высших дозах уровень ЛПНП снижался примерно наполовину после одного введения. У части пациентов наблюдались изменения показателей крови, связанные, по-видимому, с липидными частицами; испытания первого препарата приостановили и перешли к варианту с другими частицами.
- Параллельно в 2021 году впервые выполнено редактирование гена прямо в организме человека с помощью обычной Cas9: у больных наследственным транстиретиновым амилоидозом в клетках печени выключали ген белка транстиретина, и его уровень в крови снизился почти на 90 %.
Это соматическое редактирование: изменяются только клетки печени пациента, а не половые клетки, поэтому изменение не передаётся детям.
8. Риски и вопросы
- Необратимость. Таблетки можно отменить, а изменение генома — нет. Если появится неожиданный побочный эффект, его не исправить.
- Нецелевые изменения. Редактор может изменить похожие участки других генов. Их ищут, анализируя ДНК клеток после редактирования.
- Отдалённые последствия. Природные «выключатели» PCSK9 живут без вреда, но наблюдения за пациентами после редактирования длятся пока всего несколько лет.
- Кому лечить. Пока испытания проводят у людей с наследственно высоким холестерином и уже развившимся атеросклерозом. Обсуждается, можно ли в будущем делать такое «однократное лечение» в профилактических целях.
Повторить тему можно в уроке «Геномное редактирование и генная терапия» и в тренажёре по теме 3.7.
Частые ошибки. 1) «Весь холестерин вреден» — холестерин необходим для мембран и синтеза гормонов; вреден его избыток в составе ЛПНП. 2) «Редактирование гена PCSK9 наследуется детьми» — редактируются только клетки печени (соматические). 3) «Редактор оснований вставляет новый ген» — он заменяет одну пару нуклеотидов.
9. Для олимпиад
Почему выбрали место сплайсинга
Редактор аденина может превратить А в Г, но не любую замену можно так получить. Чтобы выключить ген, нужно либо создать стоп-кодон (это требует замены Ц на Т, и для этого есть другой, цитидиновый редактор), либо нарушить сплайсинг. Граница экзона и интрона в пре-мРНК почти у всех генов начинается с ГУ на 5′-конце интрона. Если изменить консервативный нуклеотид в этом месте, сплайсосома не узнает границу, интрон останется в мРНК или экзон будет пропущен, и рамка считывания нарушится.
Ирония доставки
Липидные наночастицы попадают в клетки печени через рецепторы ЛПНП. У пациентов с тяжёлой гомозиготной семейной гиперхолестеринемией, у которых рецепторов нет, такие частицы плохо доставляются в печень. Поэтому новые препараты снабжают дополнительным «адресом» — молекулами, связывающимися с другим рецептором клеток печени (рецептором асиалогликопротеинов).
Задания с разбором
Сначала ответьте сами, затем откройте разбор.
Задание 1
Объясните, почему у людей с мутацией, выключающей ген PCSK9, уровень холестерина в крови снижен.
Разбор
1) Белок PCSK9 связывается с рецепторами ЛПНП и направляет их на разрушение в лизосомах. 2) Без PCSK9 рецепторы возвращаются на поверхность клеток печени многократно, и их становится больше. 3) Клетки печени активнее захватывают ЛПНП из крови путём эндоцитоза, и уровень холестерина ЛПНП снижается.
Задание 2
Какие функции выполняет холестерин в организме? Почему опасен избыток холестерина ЛПНП?
Разбор
1) Входит в состав мембран клеток животных, регулирует их текучесть. 2) Служит исходным веществом для синтеза стероидных гормонов, желчных кислот, витамина D. 3) Избыток ЛПНП приводит к отложению холестерина в стенках артерий — атеросклеротическим бляшкам, сужению сосудов, риску инфаркта и инсульта.
Задание 3
Сравните действие антител к PCSK9 и малой интерферирующей РНК против мРНК PCSK9. На каком уровне каждый препарат влияет на белок?
Разбор
1) Антитела связывают уже синтезированный белок PCSK9 в крови и мешают ему соединиться с рецептором — действие на уровне готового белка. 2) Малая интерферирующая РНК в клетках печени разрушает мРНК PCSK9, и белок не синтезируется — действие на уровне трансляции. 3) Редактирование гена действует на уровне ДНК.
Задание 4
Почему редактирование гена PCSK9 в клетках печени не передаётся по наследству детям пациента?
Разбор
1) Изменяется ДНК только соматических клеток печени. 2) Половые клетки образуются в гонадах из клеток зародышевого пути, которые не подвергались редактированию. 3) Поэтому потомство получает неизменённые гены.
Задание 5
Чем редактор оснований отличается от обычной системы CRISPR-Cas9? Почему он считается более безопасным?
Разбор
1) Обычная Cas9 разрезает обе цепи ДНК, а изменение возникает при восстановлении разрыва (часто случайные вставки и выпадения). 2) Редактор оснований разрезает только одну цепь и химически превращает одно основание в другое (А в Г) в заданном месте. 3) Без двухцепочечного разрыва меньше риск крупных перестроек хромосом и непредсказуемых изменений.
Задание 6 (олимпиадное)
Почему для выключения гена PCSK9 редактором аденина выбрали нуклеотид в месте сплайсинга, а не в середине кодирующей части?
Разбор
1) Редактор аденина превращает А в Г; такая замена в кодирующей части чаще меняет одну аминокислоту (или вовсе не меняет её из-за вырожденности кода), и белок может остаться рабочим. 2) Создать стоп-кодон заменой А на Г нельзя: ни один смысловой кодон не превращается в УАА, УАГ или УГА при замене А на Г (а на другой цепи такая замена соответствует замене Т на Ц, которая тоже не даёт стоп-кодонов). 3) Место сплайсинга консервативно: замена в нём нарушает узнавание границы экзона и интрона, мРНК созревает неправильно, и функционального белка нет.
Литература
- Abifadel M. et al. Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia // Nature Genetics. 2003. Vol. 34. P. 154–156.
- Cohen J. C. et al. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease // New England Journal of Medicine. 2006. Vol. 354. P. 1264–1272.
- Musunuru K. et al. In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates // Nature. 2021. Vol. 593. P. 429–434.
- Gillmore J. D. et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis // New England Journal of Medicine. 2021. Vol. 385. P. 493–502.
Обсуждение
Загружаем обсуждение…