Селекционеры тысячелетиями улучшали растения и животных, отбирая лучших и скрещивая их. В 1990-е годы тот же принцип стали применять к отдельным молекулам: в пробирке создают множество вариантов гена, отбирают тот, чей белок лучше выполняет нужную задачу, снова вносят изменения и снова отбирают. Этот метод — направленная эволюция — дал ферменты для промышленности и медицины, катализаторы реакций, которых нет в природе, и лекарственные антитела. Нобелевская премия по химии 2018 года была присуждена Фрэнсис Арнольд за направленную эволюцию ферментов, а также Джорджу Смиту и Грегори Уинтеру — за метод фагового дисплея пептидов и антител. В статье разобраны принцип метода, его этапы, главные достижения и связь с естественным отбором.
- 1. Принцип: отбор в пробирке
- 2. Цикл направленной эволюции
- 3. Первые успехи Фрэнсис Арнольд
- 4. Реакции, которых нет в природе
- 5. Фаговый дисплей и антитела
- 6. Ферменты для промышленности и экологии
- 7. Ландшафт приспособленности
- 8. Направленная эволюция и искусственный интеллект
- 9. Для олимпиад
- Задания с разбором
1. Принцип: отбор в пробирке
Естественный отбор требует трёх условий: изменчивости (особи различаются), наследственности (различия передаются потомкам) и отбора (одни варианты оставляют больше потомков, чем другие). Если эти условия создать в лаборатории для молекул, они будут «эволюционировать» в нужном направлении.
| Условие | В природе | В направленной эволюции |
|---|---|---|
| Изменчивость | Случайные мутации и рекомбинация | Искусственный мутагенез гена, перетасовка генов |
| Наследственность | Передача генов потомкам | Ген каждого варианта находится в клетке или частице, которая его синтезирует, и его можно размножить |
| Отбор | Выживание и размножение приспособленных | Экспериментатор отбирает варианты с лучшим нужным свойством |
| Скорость | Тысячи и миллионы лет | Недели — месяцы |
| Цель | Нет цели; отбирается то, что повышает выживание | Задаётся экспериментатором |
Направленная эволюция близка к искусственному отбору в селекции, но работает с одним геном и одним белком и позволяет изучать миллионы вариантов за раз.
Почему не сконструировать белок сразу, рассчитав нужные замены? Связь между последовательностью и свойствами белка очень сложна: большинство мутаций вредны, полезные часто оказываются далеко от активного центра, и предсказать их трудно. Направленная эволюция обходит эту трудность: не нужно знать, почему мутация полезна, достаточно её найти.
2. Цикл направленной эволюции
- Создание разнообразия.
- ПЦР с ошибками: ПЦР проводят в условиях, при которых полимераза чаще ошибается (например, с ионами марганца и неравными количествами нуклеотидов); в каждой копии гена появляются 1–3 случайные замены (о ПЦР — в статье «ПЦР»).
- Перетасовка ДНК (Виллем Стеммер, 1994): родственные гены режут на фрагменты и собирают заново, получая сочетания участков разных генов — аналог рекомбинации при половом размножении.
- Насыщающий мутагенез: в выбранных положениях перебирают все 20 аминокислот.
- Экспрессия. Библиотеку вариантов вводят в бактерии или дрожжи так, чтобы каждая клетка синтезировала один вариант белка.
- Отбор или скрининг.
- скрининг — проверка каждого варианта отдельно (например, по окраске продукта в лунках планшета); тысячи вариантов;
- отбор — создание условий, при которых выживают только клетки с хорошим вариантом (например, фермент разрушает антибиотик или синтезирует необходимое вещество); миллионы и миллиарды вариантов.
- Размножение лучших. Гены лучших вариантов выделяют, и они становятся исходными для следующего цикла.
Главное правило метода Фрэнсис Арнольд: «получаешь то, что отбираешь». Если скрининг измеряет не то свойство, которое нужно, эволюция пойдёт в другом направлении.
3. Первые успехи Фрэнсис Арнольд
Фрэнсис Арнольд — американский инженер-химик из Калифорнийского технологического института. В начале 1990-х годов она пыталась «рационально» изменить фермент субтилизин (протеазу бактерии сенной палочки), чтобы он работал в органическом растворителе диметилформамиде, разрушающем большинство белков. Расчёты не помогали. Тогда она применила случайный мутагенез и отбор: после трёх циклов вариант фермента работал в 60 % растворе диметилформамида в 256 раз активнее исходного. Полезные замены оказались в местах, которые никто бы не предсказал.
4. Реакции, которых нет в природе
Ферменты нередко способны катализировать, кроме основной, слабые побочные реакции (это свойство называют неразборчивостью). Направленная эволюция может усилить такую побочную реакцию и превратить её в основную. Так в лаборатории Арнольд получили:
- варианты цитохрома P450, присоединяющие к двойной связи углеводорода одноуглеродную группу — образующие циклопропаны (2013);
- вариант цитохрома c бактерии из горячих источников, образующий связь углерод — кремний (2016) — реакцию, неизвестную в живой природе; после нескольких циклов фермент работал в 15 раз эффективнее лучших химических катализаторов;
- ферменты, образующие связь углерод — бор (2017).
Такие ферменты работают в воде при комнатной температуре и не требуют редких металлов и ядовитых растворителей, что делает химическое производство «зеленее».
5. Фаговый дисплей и антитела
Чтобы отбирать белки по способности связываться с мишенью, нужно, чтобы белок и его ген были связаны физически. В 1985 году Джордж Смит предложил использовать бактериофаги: ген пептида встраивают в ген белка оболочки нитчатого фага, и пептид оказывается на поверхности частицы, а его ген — внутри неё. Этот метод назвали фаговым дисплеем.
- Получают библиотеку из миллиардов фагов, каждый несёт на поверхности свой вариант пептида или фрагмента антитела.
- Фаги наносят на поверхность с закреплённой мишенью (например, белком-рецептором); несвязавшиеся смывают.
- Связавшиеся фаги снимают и размножают в бактериях.
- Цикл повторяют, усиливая требования (меньше мишени, жёстче промывка); варианты, связывающиеся всё прочнее, накапливаются.
Грегори Уинтер применил фаговый дисплей к антителам человека. Так был получен адалимумаб — первое полностью человеческое моноклональное антитело, одобренное в 2002 году для лечения ревматоидного артрита. Антитело связывает белок воспаления — фактор некроза опухоли. Сейчас фаговым дисплеем получено множество лекарственных антител, в том числе против опухолей и токсинов.
6. Ферменты для промышленности и экологии
- Моющие средства: протеазы и липазы, работающие в холодной воде и в щелочной среде стирального порошка.
- Производство лекарств: в 2010 году фермент трансаминаза был изменён направленной эволюцией (27 замен) так, что стал синтезировать противодиабетический препарат ситаглиптин; ферментный процесс заменил химический, требовавший дорогого родиевого катализатора и высокого давления.
- Разрушение пластика: в 2016 году японские исследователи нашли бактерию Ideonella sakaiensis, питающуюся полиэтилентерефталатом (ПЭТ, материал пластиковых бутылок), и её фермент ПЭТазу. Природный фермент работает медленно, а варианты, полученные направленной эволюцией и рациональным конструированием, разлагают пластик за часы и дни; во Франции строят завод ферментной переработки ПЭТ.
- Биотопливо: ферменты для расщепления целлюлозы растительных отходов.
7. Ландшафт приспособленности
Эволюцию удобно представлять как движение по ландшафту приспособленности: каждой последовательности соответствует «высота» — значение нужного свойства. Направленная эволюция — подъём в гору мелкими шагами (одна-две замены за цикл).
- Если ландшафт гладкий, подъём лёгок: каждая полезная замена прибавляет немного.
- Если ландшафт изрезан, эволюция может застрять на локальной вершине: любая одиночная замена ухудшает белок, хотя где-то есть более высокая вершина. Тогда помогают рекомбинация (перетасовка) и сразу несколько замен.
- Эпистаз — зависимость эффекта мутации от других мутаций. Замена, вредная сама по себе, может стать полезной после другой. Поэтому порядок мутаций важен.
- Многие полезные для функции мутации снижают устойчивость белка. Поэтому сначала полезно повысить устойчивость (например, начать с фермента термофила): устойчивый белок «выдерживает» больше мутаций и легче эволюционирует.
Те же закономерности проявляются в природе: например, у бактерий устойчивость к антибиотикам часто возникает через определённую последовательность мутаций, и не все пути к ней доступны.
8. Направленная эволюция и искусственный интеллект
Узкое место метода — скрининг: проверить можно тысячи вариантов, а возможных последовательностей — астрономически много. Сейчас направленную эволюцию сочетают с машинным обучением:
- проверяют небольшую выборку вариантов;
- по результатам обучают модель, предсказывающую свойства ещё не проверенных вариантов;
- синтезируют и проверяют лучшие предсказанные варианты; повторяют.
Модели, обученные на миллионах природных последовательностей белков (белковые языковые модели), и программы предсказания структуры (см. статью «AlphaFold») помогают выбрать, где вносить мутации. Это сокращает число циклов, но эксперимент по-прежнему решающий: предсказания проверяют в пробирке.
Повторить методы селекции и биотехнологии можно в уроках «Методы селекции: искусственный отбор, мутагенез» и «Биотехнология», а также в тренажёре по теме 3.6.
Частые ошибки. 1) «Направленная эволюция — это внесение заранее рассчитанных мутаций» — мутации вносятся случайно, направление задаёт отбор. 2) «Мутации направленно полезны» — большинство вредны или нейтральны; полезные находят отбором. 3) «Фаговый дисплей — заражение человека вирусами» — фаги размножают в бактериях в пробирке, лечат полученными антителами.
9. Для олимпиад
Сколько вариантов можно проверить
У белка из 300 аминокислот одиночных замен 300 · 19 = 5700 — все можно проверить скринингом. Двойных — около 1,6 · 107, уже только отбором. Тройных — около 3 · 1010, что близко к пределу даже для фагового дисплея (109–1011 вариантов). Поэтому направленная эволюция идёт мелкими шагами: в каждом цикле — одна-две замены, а нужное сочетание собирается за несколько циклов.
Нейтральный дрейф
Если отбирать только варианты, сохраняющие функцию на прежнем уровне, в популяции накапливаются «нейтральные» мутации. Они не меняют нужное свойство, но меняют устойчивость и способность к другим реакциям. Такие популяции затем быстрее приобретают новые функции — разнообразие, «скрытое» за одинаковым свойством, служит запасом изменчивости. Это лабораторная модель того, что в природе называют резервом изменчивости.
Задания с разбором
Сначала ответьте сами, затем откройте разбор.
Задание 1
Какие условия естественного отбора воспроизводятся в направленной эволюции? Чем направленная эволюция отличается от естественного отбора?
Разбор
1) Изменчивость (случайный мутагенез, перетасовка генов), наследственность (ген варианта связан с белком и размножается), отбор лучших вариантов. 2) Отличия: отбор проводит экспериментатор по заданному признаку, а не среда по выживанию; процесс занимает недели; объект — один ген и белок, а не организм.
Задание 2
Чем скрининг отличается от отбора в направленной эволюции? Когда используют каждый из них?
Разбор
1) Скрининг — проверка каждого варианта отдельно; позволяет измерить свойство количественно, но охватывает тысячи вариантов. 2) Отбор — условия, при которых выживают или задерживаются только носители нужного варианта; охватывает миллионы и миллиарды вариантов, но требует связать свойство с выживанием или связыванием. 3) Скрининг используют, когда свойство нельзя связать с выживанием (например, работа в растворителе); отбор — когда можно (разрушение антибиотика, связывание с мишенью в фаговом дисплее).
Задание 3
Почему в фаговом дисплее важно, что пептид находится на поверхности фага, а его ген — внутри той же частицы?
Разбор
1) Отбор идёт по свойству пептида (связыванию с мишенью). 2) Чтобы размножить отобранный вариант, нужен его ген. 3) Поскольку пептид и кодирующий его ген находятся в одной частице, связавшийся фаг несёт «инструкцию» к своему пептиду и размножается в бактериях — связь генотипа и фенотипа, как у организмов в природе.
Задание 4
Почему в направленной эволюции часто начинают работу с ферментов термофильных бактерий?
Разбор
1) Белки термофилов устойчивее к нагреванию и разворачиванию. 2) Большинство мутаций, в том числе полезных для функции, снижают устойчивость белка. 3) Устойчивый исходный белок «выдерживает» больше мутаций, оставаясь свёрнутым, поэтому его легче изменять.
Задание 5 (олимпиадное)
При направленной эволюции фермента две замены, каждая из которых по отдельности снижает активность, вместе повышают её в 10 раз. Как называется это явление? Почему оно затрудняет эволюцию мелкими шагами?
Разбор
1) Эпистаз — зависимость эффекта мутации от наличия других мутаций (в данном случае — взаимная компенсация). 2) При отборе по одной замене за цикл каждая из этих мутаций отсеивается как вредная, и сочетание никогда не будет найдено. 3) Чтобы обойти локальную вершину, нужны рекомбинация, одновременное внесение нескольких замен в выбранные положения или отбор с ослабленными требованиями, позволяющий сохранять нейтральные и слабовредные варианты.
Литература
- Chen K., Arnold F. H. Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide // PNAS. 1993. Vol. 90. P. 5618–5622.
- Stemmer W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling // Nature. 1994. Vol. 370. P. 389–391.
- Smith G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface // Science. 1985. Vol. 228. P. 1315–1317.
- Kan S. B. J. et al. Directed evolution of cytochrome c for carbon–silicon bond formation: bringing silicon to life // Science. 2016. Vol. 354. P. 1048–1051.
- Savile C. K. et al. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture // Science. 2010. Vol. 329. P. 305–309.
Обсуждение
Загружаем обсуждение…