Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — способ многократно размножить (амплифицировать) выбранный участок ДНК в пробирке. Из нескольких молекул за пару часов получают миллиарды копий, которые можно увидеть, измерить и изучить. ПЦР используется в диагностике инфекций, криминалистике, установлении родства, изучении древней ДНК, селекции, генной инженерии. Для олимпиад нужно понимать не только этапы, но и логику: почему нужны именно такие компоненты и температуры, как растёт число копий, откуда берутся ошибки и как устроены варианты метода. Всё это разобрано в статье по порядку.
- 1. Основа: репликация ДНК
- 2. Компоненты реакции
- 3. Цикл ПЦР
- 4. Как растёт число копий
- 5. Откуда берётся продукт нужной длины
- 6. Праймеры и специфичность
- 7. Как увидеть результат
- 8. Варианты ПЦР
- 9. Применение
- 10. Ошибки и загрязнения
- 11. Для олимпиад: расчёты
- Задания с разбором
1. Основа: репликация ДНК
ПЦР повторяет в пробирке главные события репликации ДНК. Нужно помнить:
- ДНК-полимераза синтезирует новую цепь по принципу комплементарности на матричной цепи;
- новая цепь растёт только от 5′-конца к 3′-концу: полимераза присоединяет нуклеотид к 3′-OH-группе последнего нуклеотида;
- полимераза не может начать цепь «с нуля»: ей нужна затравка (праймер) — короткий участок, уже спаренный с матрицей и имеющий свободный 3′-конец. В клетке затравку синтезирует фермент праймаза из РНК; в ПЦР добавляют готовые ДНК-праймеры.
Главное отличие ПЦР от репликации в клетке: цепи ДНК разделяют не ферментом-хеликазой, а нагреванием.
2. Компоненты реакции
| Компонент | Роль |
|---|---|
| Матричная ДНК | Образец, содержащий нужный участок (может быть всего несколько молекул) |
| Два праймера | Короткие однонитевые ДНК (18–25 нуклеотидов), комплементарные концам нужного участка на разных цепях; определяют, что будет размножено |
| Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) | Строительный материал и источник энергии для образования связей |
| Термостабильная ДНК-полимераза | Синтезирует новые цепи; выдерживает многократный нагрев до 95 °C |
| Ионы магния | Необходимы для работы полимеразы |
| Буферный раствор | Поддерживает нужный pH и концентрацию солей |
Термостабильную полимеразу впервые выделили из бактерии Thermus aquaticus, живущей в горячих источниках (Taq-полимераза). Её история — в статье «Taq-полимераза».
3. Цикл ПЦР
Реакцию проводят в приборе — амплификаторе (термоциклере), который быстро меняет температуру. Один цикл состоит из трёх этапов:
- Денатурация (94–98 °C, 15–30 с). Водородные связи между цепями ДНК разрываются, двойная спираль разделяется на одиночные цепи.
- Отжиг праймеров (обычно 50–65 °C, 15–30 с). При охлаждении праймеры присоединяются к комплементарным участкам одиночных цепей. Праймеров в смеси гораздо больше, чем матрицы, поэтому они успевают связаться раньше, чем длинные цепи матрицы снова соединятся друг с другом.
- Элонгация (72 °C — оптимум Taq-полимеразы). Полимераза достраивает цепи от 3′-конца праймеров. Скорость синтеза — около 1000 нуклеотидов в минуту.
Обычно проводят 25–40 циклов; вся реакция занимает 1–2 часа.
4. Как растёт число копий
В каждом цикле число молекул нужного участка в идеальном случае удваивается. Из одной молекулы после n циклов получается 2n молекул: после 10 циклов — около тысячи, после 20 — около миллиона, после 30 — около миллиарда.
На практике эффективность каждого цикла меньше 100 %, а в конце реакции рост замедляется и прекращается (выход на плато): заканчиваются праймеры и нуклеотиды, полимераза теряет активность, накопленные продукты чаще соединяются друг с другом, чем с праймерами. Поэтому число циклов больше 40 обычно не используют.
5. Откуда берётся продукт нужной длины
Это ключевой вопрос для понимания метода. Праймеры задают начало новых цепей, но в первых циклах конец цепи ничем не ограничен.
- Цикл 1. На каждой из двух исходных длинных цепей синтезируется новая цепь, которая начинается от праймера, но продолжается за пределы нужного участка, пока не закончится время синтеза. Получаются «длинные» продукты, ограниченные только с одного конца.
- Цикл 2. Праймеры присоединяются и к исходным цепям, и к «длинным» продуктам. На «длинном» продукте синтез идёт до его конца, а его конец совпадает с позицией второго праймера. Так появляются первые цепи, ограниченные праймерами с обоих концов.
- Цикл 3. Впервые образуются двухцепочечные молекулы точно нужной длины — обе цепи ограничены праймерами.
- Дальше молекулы нужной длины растут экспоненциально, а «длинные» продукты — только линейно (на 2 за цикл). Через 30 циклов продуктов нужной длины в сотни миллионов раз больше.
Именно поэтому длина продукта ПЦР равна расстоянию между внешними концами праймеров, включая сами праймеры.
6. Праймеры и специфичность
От праймеров зависит, будет ли размножен только нужный участок. Требования к ним:
- длина 18–25 нуклеотидов: такая последовательность встречается в геноме случайно крайне редко (одна определённая последовательность из 20 нуклеотидов встречается в среднем один раз на 420 ≈ 1012 нуклеотидов, а геном человека — 3 · 109);
- содержание Г + Ц около 40–60 %: пары Г — Ц соединены тремя водородными связями, А — Т — двумя, поэтому от состава зависит температура плавления праймера;
- оба праймера должны иметь близкие температуры плавления;
- праймеры не должны быть комплементарны друг другу и сами себе, особенно на 3′-концах, иначе образуются «димеры праймеров»;
- 3′-конец праймера должен точно совпадать с матрицей: полимераза достраивает именно его.
Температуру отжига выбирают на несколько градусов ниже температуры плавления праймеров. При слишком низкой температуре праймеры связываются и с неполностью комплементарными участками — появляются лишние продукты; при слишком высокой — не связываются вовсе.
7. Как увидеть результат
- Электрофорез в агарозном геле. Продукты ПЦР помещают в лунки геля и пропускают электрический ток. ДНК заряжена отрицательно (из-за фосфатов) и движется к положительному электроду; короткие молекулы движутся быстрее длинных. ДНК окрашивают флуоресцентным красителем и видят полосы; размер определяют по сравнению с маркёром — смесью фрагментов известной длины.
- ПЦР в реальном времени (количественная). В смесь добавляют краситель, светящийся при связывании с двухцепочечной ДНК, или специальный зонд. Прибор измеряет свечение после каждого цикла.
8. Варианты ПЦР
| Вариант | Суть | Для чего |
|---|---|---|
| ПЦР с обратной транскрипцией | Сначала фермент обратная транскриптаза синтезирует ДНК на матрице РНК, затем проводят ПЦР | Обнаружение РНК-вирусов (грипп, коронавирус, ВИЧ), изучение работы генов (мРНК) |
| ПЦР в реальном времени | Наблюдение за накоплением продукта по флуоресценции | Измерение количества исходной ДНК или РНК (вирусная нагрузка) |
| Мультиплексная ПЦР | Несколько пар праймеров в одной пробирке | Одновременное определение нескольких возбудителей, анализ многих участков ДНК в криминалистике |
| Гнездовая ПЦР | Вторая ПЦР с праймерами внутри продукта первой | Повышение чувствительности и специфичности |
| Изотермическая амплификация | Размножение ДНК при постоянной температуре с помощью полимеразы, вытесняющей цепь, без нагрева до 95 °C | Быстрые тесты без сложного прибора |
В ПЦР в реальном времени с зондом используется ещё одно свойство Taq-полимеразы: она разрушает цепь, встретившуюся ей на пути. Зонд — короткая ДНК, присоединяющаяся внутри нужного участка, на одном конце которой флуоресцентная метка, а на другом — гаситель свечения. Пока зонд цел, свечения нет. Полимераза, достраивая цепь, разрушает зонд, метка отделяется от гасителя и начинает светиться. Свечение растёт пропорционально числу копий.
9. Применение
- Медицинская диагностика: обнаружение вирусов и бактерий по их ДНК или РНК, выявление мутаций наследственных болезней и опухолей.
- Криминалистика и установление родства: анализ коротких тандемных повторов — участков, где короткая последовательность повторяется разное число раз у разных людей. По набору таких участков человека можно опознать по капле крови или волосу.
- Древняя ДНК: размножение фрагментов ДНК из костей вымерших животных и древних людей. Сванте Пэабо, изучивший геном неандертальца, получил Нобелевскую премию 2022 года.
- Генная инженерия: получение фрагментов генов для переноса в векторы, внесение мутаций.
- Экология: определение видов по следам ДНК в воде и почве.
10. Ошибки и загрязнения
- Ошибки полимеразы. Taq-полимераза не исправляет собственные ошибки (у неё нет корректирующей активности 3′→5′-экзонуклеазы) и ошибается примерно раз на 104–105 нуклеотидов. Для клонирования генов используют полимеразы с корректирующей активностью (например, из археи Pyrococcus furiosus), ошибающиеся в десятки раз реже.
- Загрязнение. ПЦР настолько чувствительна, что одна посторонняя молекула ДНК из воздуха лаборатории или с рук может дать ложный результат. Поэтому всегда ставят отрицательный контроль — пробирку со всеми компонентами, но без образца: продукта в ней быть не должно. Положительный контроль — заведомо содержащий нужную ДНК образец — проверяет, что реакция вообще работает.
- Ингибиторы. Вещества из образца (гем крови, полисахариды растений, гуминовые кислоты почвы) могут подавлять полимеразу и давать ложноотрицательный результат.
Повторить репликацию ДНК можно в уроке «Репликация ДНК», а методы генной инженерии — в уроке «Генная инженерия» и в тренажёре по теме 2.1.
11. Для олимпиад: расчёты
Число копий
Если исходно было N0 молекул, а эффективность цикла E (доля молекул, удвоившихся за цикл), то после n циклов: N = N0 · (1 + E)n. При E = 1 (100 %) — удвоение за цикл.
Продукты точной длины
Из одной двухцепочечной молекулы матрицы после n циклов (при 100 % эффективности) образуется 2n двухцепочечных молекул, из них молекул точной длины: 2n − 2n. Проверка: после 3 циклов 8 − 6 = 2 — как раз первые две молекулы нужной длины появляются в третьем цикле.
Пороговый цикл
В ПЦР в реальном времени определяют пороговый цикл — номер цикла, на котором свечение превышает фоновый уровень. Чем больше исходной ДНК, тем раньше достигается порог. Разница в один цикл соответствует двукратной разнице в исходном количестве, а разница примерно в 3,3 цикла — десятикратной (так как 23,3 ≈ 10).
Задания с разбором
Сначала ответьте сами, затем откройте разбор.
Задание 1
Зачем в ПЦР нагревают смесь до 95 °C? Почему для этого нужна полимераза из бактерии горячих источников?
Разбор
1) Нагревание разрывает водородные связи между цепями ДНК и разделяет их — так получаются одиночные матрицы для следующего цикла. 2) Обычные белки при 95 °C денатурируют. 3) Полимераза термофильной бактерии выдерживает многократный нагрев, поэтому её не нужно добавлять в каждом цикле.
Задание 2
Сколько молекул ДНК нужного участка получится из 5 исходных молекул после 20 циклов при 100 % эффективности? При 90 % эффективности?
Разбор
1) 5 · 220 = 5 · 1 048 576 ≈ 5,2 · 106. 2) 5 · 1,920 ≈ 5 · 3,8 · 105 ≈ 1,9 · 106 — почти в три раза меньше: небольшое снижение эффективности сильно влияет на результат из-за экспоненты.
Задание 3
Почему молекулы ДНК точно нужной длины впервые появляются только в третьем цикле ПЦР?
Разбор
1) В первом цикле на исходных цепях синтезируются цепи, начинающиеся от праймера, но неограниченные с другого конца. 2) Во втором цикле на этих цепях синтез останавливается на их конце, совпадающем с местом второго праймера, — появляются отдельные цепи нужной длины. 3) В третьем цикле на цепях нужной длины синтезируются комплементарные им цепи такой же длины — образуются первые двухцепочечные молекулы нужной длины.
Задание 4
В пробирке отрицательного контроля (без образца) после ПЦР обнаружена полоса нужного размера. Как оценить результаты всех остальных проб? Что могло произойти?
Разбор
1) Результаты считают недостоверными: положительный ответ в пробах мог быть вызван загрязнением, а не наличием ДНК в образцах. 2) Возможные причины: попадание ДНК (чаще продуктов предыдущих ПЦР) в реактивы, на перчатки, в пипетки. 3) Анализ нужно повторить с новыми реактивами, разделив зоны приготовления смеси и работы с продуктами.
Задание 5
Почему для обнаружения вируса гриппа перед ПЦР нужна обратная транскрипция?
Разбор
1) Геном вируса гриппа — РНК. 2) Taq-полимераза — ДНК-полимераза, использующая в качестве матрицы ДНК. 3) Поэтому сначала обратная транскриптаза синтезирует ДНК, комплементарную вирусной РНК, а затем эта ДНК размножается в ПЦР.
Задание 6
Праймер имеет последовательность 5′-ГЦГЦГЦГЦГЦ-3′. Назовите два недостатка такого праймера.
Разбор
1) Он слишком короткий (10 нуклеотидов): такая последовательность часто встречается в геноме случайно, и праймер будет связываться во многих местах. 2) Он самокомплементарен (ГЦГЦ… спаривается сам с собой), образует димеры и шпильки. 3) Содержание Г + Ц 100 % — слишком высокая температура плавления и неустойчивое связывание с ошибками.
Задание 7
Почему для получения гена, который будут встраивать в бактерию для синтеза лекарственного белка, используют не Taq-, а другую термостабильную полимеразу?
Разбор
1) Taq-полимераза не имеет корректирующей 3′→5′-экзонуклеазной активности и вносит ошибки примерно раз на 104–105 нуклеотидов. 2) Ошибки в гене изменят аминокислотную последовательность белка. 3) Полимеразы с корректирующей активностью (например, Pfu из археи Pyrococcus furiosus) ошибаются в десятки раз реже.
Задание 8 (олимпиадное)
В ПЦР в реальном времени образец А достиг порога на 24-м цикле, образец Б — на 30-м. Во сколько раз исходное количество ДНК в образце А больше, чем в Б (эффективность 100 %)?
Разбор
Разница 6 циклов. Каждый цикл удваивает количество, поэтому в образце А исходно было в 26 = 64 раза больше ДНК.
Задание 9 (олимпиадное)
Сколько двухцепочечных молекул точно нужной длины образуется из одной молекулы матрицы после 5 циклов? Какая доля всех двухцепочечных молекул это составляет?
Разбор
1) Всего молекул 25 = 32. 2) Нужной длины 25 − 2 · 5 = 32 − 10 = 22. 3) Доля 22/32 ≈ 69 %. После 30 циклов доля превышает 99,99 %.
Задание 10 (олимпиадное)
Предложите способ определить методом ПЦР, есть ли в образце ДНК бактерии, но нет ДНК человека, если образец взят из раны пациента. Какие праймеры и контроли нужны?
Разбор
1) Праймеры к участку гена, который есть у бактерии и отсутствует у человека (например, к гену 16S рРНК бактерий или к гену токсина конкретного возбудителя). 2) Отдельная реакция с праймерами к гену человека (например, к гену белка, работающего во всех клетках) — контроль качества выделения ДНК и отсутствия ингибиторов. 3) Отрицательный контроль без образца и положительный контроль с ДНК возбудителя. 4) Продукты проверить электрофорезом по размеру или секвенированием.
Литература
- Mullis K. B., Faloona F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods in Enzymology. 1987. Vol. 155. P. 335–350.
- Saiki R. K. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. Vol. 239. P. 487–491.
- Ребриков Д. В. и др. ПЦР в реальном времени. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний.
Обсуждение
Загружаем обсуждение…