CRISPR-Cas9 — система, позволяющая изменять ДНК в заданном месте генома почти любого организма. Её называют «генетическими ножницами», хотя на самом деле это сложный комплекс белка и РНК, который сам находит нужную последовательность среди миллиардов нуклеотидов. Метод возник из изучения иммунитета бактерий к вирусам и за несколько лет изменил генетику, медицину и селекцию; в 2020 году Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Даудна получили за него Нобелевскую премию по химии. В статье по порядку разобраны: как устроена система CRISPR у бактерий, как Cas9 находит и разрезает ДНК, что происходит после разреза, какие инструменты созданы на основе CRISPR и каковы ограничения метода.
- 1. Генная инженерия до CRISPR
- 2. CRISPR — иммунитет бактерий
- 3. История открытия
- 4. Компоненты системы
- 5. Как Cas9 находит мишень
- 6. Как Cas9 разрезает ДНК
- 7. Что происходит после разреза
- 8. Инструменты на основе CRISPR
- 9. Ограничения и этика
- 10. Что нужно знать к ЕГЭ
- 11. Для олимпиад
- Задания с разбором
1. Генная инженерия до CRISPR
Генная инженерия — совокупность методов получения рекомбинантной ДНК, переноса генов из одного организма в другой и изменения генов. Классические инструменты:
- ферменты рестрикции (рестриктазы) — бактериальные ферменты, разрезающие ДНК в местах с определённой короткой последовательностью (обычно 4–8 пар нуклеотидов);
- ДНК-лигаза — сшивает фрагменты ДНК;
- векторы — плазмиды и вирусы, переносящие ген в клетку.
Рестриктазы удобны в пробирке, но в геноме человека место узнавания длиной 6 нуклеотидов встречается сотни тысяч раз. Чтобы изменить один определённый ген в живой клетке, нужен инструмент, узнающий последовательность длиной около 20 нуклеотидов. До CRISPR для этого создавали искусственные белки (нуклеазы с «цинковыми пальцами», TALEN), но для каждой мишени нужно было конструировать новый белок, что занимало месяцы. CRISPR решил эту проблему: мишень задаётся короткой РНК, которую можно синтезировать за день.
2. CRISPR — иммунитет бактерий
Бактерии постоянно атакуют вирусы — бактериофаги. Около 40 % бактерий и большинство архей имеют систему приобретённого иммунитета, которая «запоминает» встреченные вирусы.
В геноме таких бактерий есть локус CRISPR (от англ. «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами»): одинаковые повторы длиной около 30 нуклеотидов, разделённые уникальными спейсерами такой же длины. Спейсеры — это фрагменты ДНК вирусов, с которыми встречались предки бактерии. Рядом находятся гены белков Cas (белки, связанные с CRISPR).
- Запоминание (адаптация). Когда вирус впрыскивает ДНК в бактерию, белки Cas1 и Cas2 вырезают из неё фрагмент и встраивают в начало локуса CRISPR в качестве нового спейсера. Бактерия и её потомки получают «память» о вирусе.
- Подготовка оружия (экспрессия). Локус CRISPR транскрибируется в длинную РНК, которая разрезается на короткие crРНК; каждая содержит один спейсер.
- Защита (интерференция). crРНК в комплексе с белком Cas (у Streptococcus pyogenes — Cas9) находит ДНК вируса, комплементарную спейсеру, и разрезает её.
Это наследуемая память: спейсеры передаются потомкам, то есть бактерии наследуют приобретённый иммунитет — пример наследования приобретённого признака, который напоминает идеи Ламарка.
3. История открытия
- 1987 — японские исследователи (Йосидзуми Исино и соавторы) обнаружили у кишечной палочки странные повторы, назначение которых было неясно.
- 1993–2005 — испанский микробиолог Франсиско Мохика изучал повторы у архей солончаков, предложил название CRISPR и заметил, что спейсеры совпадают с последовательностями вирусов. Он предположил, что это система иммунитета.
- 2007 — сотрудники датской компании, производящей закваски для йогурта (Родольф Баррангу и соавторы), показали на бактерии Streptococcus thermophilus, что после заражения фагом устойчивые бактерии получают новые спейсеры из ДНК этого фага, и устойчивость определяется именно ими.
- 2011 — группа Константина Северинова показала, что для узнавания мишени особенно важен участок спейсера рядом с PAM («затравочная» последовательность): одна неспаренная пара в нём отменяет защиту.
- 2012 — Мартин Йинек, Эмманюэль Шарпантье, Дженнифер Даудна и соавторы показали, что Cas9 с двумя РНК разрезает ДНК в пробирке в месте, заданном РНК, и что две РНК можно объединить в одну «направляющую».
- 2013 — группы Фэна Чжана и Джорджа Чёрча применили CRISPR-Cas9 для редактирования генов в клетках человека.
4. Компоненты системы
| Компонент | Строение | Роль |
|---|---|---|
| Белок Cas9 | Крупный белок (около 1370 аминокислот) с двумя нуклеазными доменами — HNH и RuvC | Связывает РНК, узнаёт PAM, расплетает ДНК, разрезает обе цепи |
| crРНК | Около 40 нуклеотидов; 20 из них комплементарны мишени | Задаёт адрес разреза |
| tracrРНК | РНК, частично спаренная с crРНК | Удерживает crРНК в комплексе с Cas9 |
| Направляющая РНК (sgРНК) | Искусственное объединение crРНК и tracrРНК в одну молекулу (около 100 нуклеотидов) | Используется в лаборатории вместо двух РНК |
| PAM | Короткая последовательность ДНК рядом с мишенью (у Cas9 S. pyogenes — НГГ: любой нуклеотид и два гуанина) | Обязательный «сигнал» для связывания Cas9 |
Зачем нужен PAM? В самом локусе CRISPR бактерии спейсеры тоже есть, и Cas9 могла бы разрезать собственную ДНК. Но рядом со спейсерами в локусе нет PAM, а рядом с соответствующими участками вируса — есть. Так система отличает «своё» от «чужого».
5. Как Cas9 находит мишень
- Cas9 связывает направляющую РНК и меняет форму, становясь готовой к поиску.
- Комплекс скользит по ДНК и кратковременно связывается с участками, где есть PAM (НГГ). Проверять весь геном на совпадение с 20 нуклеотидами было бы слишком долго, а проверка трёх нуклеотидов PAM занимает мгновения.
- Найдя PAM, Cas9 расплетает соседний участок двойной спирали, начиная от PAM.
- Направляющая РНК пытается спариться с одной цепью ДНК. Сначала проверяется участок из 10–12 нуклеотидов, ближайших к PAM (затравочный участок). Если там есть несовпадения, комплекс отходит.
- Если затравочный участок совпадает, спаривание продолжается на все 20 нуклеотидов. Образуется гибрид РНК — ДНК, а вторая цепь ДНК вытесняется («R-петля»).
6. Как Cas9 разрезает ДНК
Полное спаривание вызывает перестройку белка, и два нуклеазных домена встают на место:
- домен HNH разрезает цепь, спаренную с РНК (комплементарную);
- домен RuvC разрезает вытесненную цепь.
Обе цепи разрезаются в одном месте — в 3 нуклеотидах от PAM. Образуется двухцепочечный разрыв с ровными (тупыми) концами. Химически это гидролиз фосфодиэфирных связей с участием ионов магния — такая же реакция, как у рестриктаз.
7. Что происходит после разреза
Сама Cas9 только разрезает ДНК. Изменение гена производит клетка, восстанавливая разрыв одним из двух путей.
| Путь | Как идёт | Результат | Для чего используют |
|---|---|---|---|
| Негомологичное соединение концов | Концы сшиваются напрямую, часто с потерей или вставкой нескольких нуклеотидов | Небольшие вставки и выпадения в месте разреза; часто — сдвиг рамки считывания | «Выключение» гена (нокаут) |
| Гомологичная репарация | Разрыв восстанавливается по образцу — молекуле ДНК со сходной последовательностью | Точное изменение, заданное образцом | Исправление мутации, вставка гена |
Почему вставка или выпадение одного-двух нуклеотидов «выключает» ген? Генетический код читается триплетами; выпадение нуклеотида сдвигает рамку считывания, и после места мутации все кодоны читаются неверно, а вскоре встречается стоп-кодон. Белок получается укороченным и нерабочим.
Негомологичное соединение работает в любой клетке и быстро. Гомологичная репарация идёт в основном в делящихся клетках (в S- и G2-периодах, когда есть сестринская хроматида) и гораздо реже, поэтому точное исправление гена в неделящихся клетках (нейронах, клетках печени) — трудная задача. Её решают инструменты, описанные ниже.
8. Инструменты на основе CRISPR
| Инструмент | Устройство | Возможности |
|---|---|---|
| «Мёртвая» Cas9 (dCas9) | Оба нуклеазных домена выключены мутациями; белок связывается с мишенью, но не режет | Подавление гена (закрывает промотор) или его включение (если присоединить активатор транскрипции); метка для наблюдения участка ДНК |
| Редакторы оснований | Cas9, разрезающая только одну цепь, соединённая с ферментом, превращающим одно основание в другое (например, А в Г или Ц в Т) | Замена одного нуклеотида без двухцепочечного разрыва |
| Праймированное редактирование | Cas9-никаза, соединённая с обратной транскриптазой; направляющая РНК несёт шаблон нужной последовательности | Небольшие замены, вставки и выпадения без разрыва и без образца ДНК |
| Cas12 | Другой белок CRISPR, узнаёт иной PAM, делает разрез с выступающими концами | Расширение выбора мишеней; диагностика |
| Cas13 | Белок, разрезающий РНК, а не ДНК | Подавление мРНК, обнаружение РНК вирусов |
В диагностике используют интересное свойство Cas12 и Cas13: найдя свою мишень, они начинают разрезать любые одноцепочечные молекулы вокруг. Если добавить в пробу короткие меченые молекулы, при наличии вирусной ДНК или РНК они разрезаются, и появляется свечение. Такие тесты обнаруживают вирус за час без сложного оборудования.
Применение редактирования в медицине разобрано на примере гена PCSK9 в статье «Редактирование гена PCSK9». В 2023 году в Великобритании и США одобрен первый препарат на основе CRISPR — для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии: стволовые клетки крови пациента редактируют вне организма, включая синтез фетального гемоглобина, и возвращают обратно.
9. Ограничения и этика
- Нецелевые разрезы. Cas9 иногда режет участки, похожие на мишень, с 1–3 несовпадениями вдали от PAM. Для уменьшения ошибок созданы более точные варианты белка и программы выбора направляющих РНК.
- Доставка. Белок Cas9 и РНК нужно доставить в нужные клетки организма: используют вирусные векторы и липидные наночастицы, но это не всегда эффективно и безопасно.
- Мозаицизм. Если редактирование происходит не во всех клетках, организм становится мозаикой из изменённых и неизменённых клеток.
- Иммунный ответ. Белок Cas9 — бактериальный, и у многих людей есть к нему антитела.
- Этика. Изменение генов половых клеток или эмбрионов передаётся потомкам. В 2018 году Хэ Цзянькуй объявил о рождении девочек с отредактированным геном CCR5; эксперимент осудило научное сообщество, а исследователь был приговорён к заключению. Большинство стран запрещают наследуемое редактирование генома человека.
10. Что нужно знать к ЕГЭ
- CRISPR-Cas9 — метод редактирования генома; его основа — система защиты бактерий от вирусов.
- Направляющая РНК комплементарна участку ДНК-мишени (принцип комплементарности), белок Cas9 разрезает ДНК.
- Ген можно выключить (ошибки при восстановлении разрыва) или исправить (восстановление по образцу).
- Применение: генная терапия, получение трансгенных и отредактированных организмов, селекция, изучение функций генов.
Повторить тему можно в уроке «Геномное редактирование и генная терапия» и в тренажёре по теме 3.7.
Частые ошибки. 1) «Cas9 сама вставляет нужный ген» — она только разрезает; ген изменяет клетка при восстановлении разрыва. 2) «Направляющая РНК — это мРНК» — она не кодирует белок, а служит «адресом». 3) «CRISPR — это вирус» — это локус бактериального генома и система иммунитета против вирусов. 4) «Отредактированный организм всегда трансгенный» — если изменены несколько нуклеотидов собственного гена, чужих генов в нём нет.
11. Для олимпиад
Как вирусы отвечают бактериям
Между бактериями и фагами идёт «гонка вооружений». Фаги избегают CRISPR-иммунитета мутациями в PAM или затравочном участке мишени, а также синтезом белков-ингибиторов (анти-CRISPR), которые связываются с Cas9 и блокируют её. Анти-CRISPR-белки уже используют в лаборатории как «выключатель» Cas9, чтобы ограничить время её работы и снизить нецелевые разрезы.
Как выбрать направляющую РНК
Мишень для Cas9 S. pyogenes — участок из 20 нуклеотидов, за которым на той же цепи следует НГГ. Направляющая РНК совпадает по последовательности с этой цепью (с заменой Т на У) и комплементарна другой цепи. В гене длиной 1000 пар нуклеотидов в среднем около 100 подходящих мест (ГГ встречается с вероятностью 1/16 на каждой цепи). Выбирают места в начале кодирующей части, уникальные в геноме, без похожих участков, отличающихся на 1–2 нуклеотида.
Задания с разбором
Сначала ответьте сами, затем откройте разбор.
Задание 1
Как система CRISPR защищает бактерию от вируса? Опишите три этапа.
Разбор
1) Запоминание: белки Cas встраивают фрагмент ДНК вируса в локус CRISPR в качестве нового спейсера. 2) Экспрессия: локус транскрибируется, РНК разрезается на короткие crРНК, каждая со спейсером. 3) Интерференция: crРНК в комплексе с Cas9 находит комплементарную ДНК вируса при повторном заражении, и Cas9 её разрезает.
Задание 2
Почему Cas9 не разрезает собственный локус CRISPR бактерии, хотя спейсеры в нём совпадают с crРНК?
Разбор
1) Для связывания и разрезания Cas9 требуется PAM — короткая последовательность (НГГ) рядом с мишенью. 2) В ДНК вируса PAM рядом с участком, соответствующим спейсеру, есть, а в локусе CRISPR рядом со спейсерами его нет (там стоят повторы). 3) Поэтому собственный локус не разрезается.
Задание 3
С помощью CRISPR-Cas9 в начале гена вызвали выпадение одного нуклеотида. Почему ген перестал работать?
Разбор
1) Генетический код триплетный, информация читается непрерывно тройками. 2) Выпадение нуклеотида сдвигает рамку считывания: все последующие кодоны меняются. 3) Синтезируется белок с неправильной последовательностью аминокислот, и вскоре встречается стоп-кодон — белок короткий и нефункциональный.
Задание 4
Чем направляющая РНК в системе CRISPR-Cas9 напоминает тРНК при трансляции? Чем отличается?
Разбор
1) Сходство: обе узнают нуклеиновую кислоту по принципу комплементарности (антикодон — кодон мРНК; спейсер — ДНК мишени). 2) Отличия: тРНК доставляет аминокислоту к рибосоме и узнаёт 3 нуклеотида; направляющая РНК направляет нуклеазу к ДНК и узнаёт 20 нуклеотидов; тРНК спаривается с РНК, направляющая РНК — с ДНК.
Задание 5
Почему с помощью CRISPR-Cas9 легче «выключить» ген в нервной клетке, чем исправить в нём мутацию?
Разбор
1) Выключение происходит при негомологичном соединении концов, которое работает в любой клетке. 2) Точное исправление требует гомологичной репарации по образцу, а она идёт в основном в делящихся клетках, когда есть сестринская хроматида. 3) Нейроны не делятся, гомологичная репарация в них очень редка.
Задание 6
Чем CRISPR-Cas9 удобнее ферментов рестрикции для изменения определённого гена в клетках человека?
Разбор
1) Рестриктаза узнаёт короткую последовательность (4–8 пар нуклеотидов), которая встречается в геноме много тысяч раз — разрезов будет множество. 2) Cas9 узнаёт 20 нуклеотидов плюс PAM — такая последовательность обычно уникальна. 3) Адрес задаётся РНК, которую легко синтезировать для любого гена, а не новым белком.
Задание 7
В 2007 году показали, что бактерии, выжившие после заражения фагом, становятся к нему устойчивыми и содержат в локусе CRISPR новый спейсер. Какие контрольные опыты доказывают, что устойчивость определяется именно спейсером?
Разбор
1) Удалить новый спейсер у устойчивой бактерии — она должна снова стать чувствительной. 2) Встроить такой спейсер в CRISPR чувствительной бактерии — она должна стать устойчивой. 3) Заразить устойчивую бактерию другим фагом, которому спейсер не соответствует, — устойчивости не будет. 4) Получить мутантный фаг с заменой в участке, соответствующем спейсеру, — он должен заражать «устойчивую» бактерию.
Задание 8
Почему отредактированный с помощью CRISPR сорт, в котором выключен собственный ген растения, во многих странах не считают трансгенным?
Разбор
1) Трансгенный организм содержит чужеродный ген из другого организма. 2) При выключении гена изменены лишь несколько нуклеотидов собственной ДНК, чужих генов не осталось (конструкция с геном Cas9 удаляется скрещиванием). 3) Такие изменения неотличимы от естественных мутаций, которые используются и в обычной селекции.
Задание 9 (олимпиадное)
Фрагмент кодирующей цепи гена: 5′-…АТГЦЦТАЦЦГАГГТЦААЦТГГАЦЦТГГ…-3′. Найдите последовательность PAM для Cas9 S. pyogenes на этой цепи, укажите 20 нуклеотидов мишени и место разреза.
Разбор
1) PAM — НГГ на той же цепи сразу после мишени. Сочетания ГГ во фрагменте встречаются трижды (АГГ в середине, ТГГ ближе к концу и ТГГ в самом конце), но перед первыми двумя меньше 20 нуклеотидов, поэтому подходит только последний триплет ТГГ. 2) Мишень — 20 нуклеотидов перед ним: ЦТАЦЦГАГГТЦААЦТГГАЦЦ. 3) Разрез — в 3 нуклеотидах от PAM: …ААЦТГГ | АЦЦ ТГГ. 4) Направляющая РНК совпадает с мишенью этой цепи (Т заменяется на У): 5′-ЦУАЦЦГАГГУЦААЦУГГАЦЦ-3′; она спаривается с комплементарной цепью ДНК.
Задание 10 (олимпиадное)
Предложите, как с помощью «мёртвой» Cas9 (без нуклеазной активности) временно подавить работу гена, не изменяя его последовательности. Почему такой способ удобен для изучения функций генов?
Разбор
1) Направляющую РНК подбирают к промотору или началу гена; dCas9 связывается и мешает РНК-полимеразе начать или вести транскрипцию. 2) Можно присоединить к dCas9 белок-репрессор, усиливающий подавление. 3) Последовательность гена не меняется, и при прекращении синтеза dCas9 ген снова работает — эффект обратим. 4) Так можно изучать гены, полное выключение которых смертельно для клетки, и подавлять многие гены одновременно.
Литература
- Barrangou R. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science. 2007. Vol. 315. P. 1709–1712.
- Semenova E. et al. Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence // PNAS. 2011. Vol. 108. P. 10098–10103.
- Jinek M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. Vol. 337. P. 816–821.
- Cong L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. 2013. Vol. 339. P. 819–823.
- Anzalone A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019. Vol. 576. P. 149–157.
Обсуждение
Загружаем обсуждение…