Функция белка определяется его пространственной формой, а форма — последовательностью аминокислот. Как по последовательности предсказать форму? Эта задача — «проблема сворачивания белка» — полвека оставалась одной из главных нерешённых задач биологии. В 2020 году программа AlphaFold 2 компании DeepMind научилась предсказывать структуру белков с точностью, близкой к экспериментальной, а в 2024 году AlphaFold 3 — структуру комплексов белков с ДНК, РНК и малыми молекулами. В том же году авторы AlphaFold Демис Хассабис и Джон Джампер и создатель методов конструирования белков Дэвид Бейкер получили Нобелевскую премию по химии. В статье по порядку разобраны уровни структуры белка, почему её трудно предсказать, как определяют структуру экспериментально, как работает AlphaFold и чего он не умеет.
- 1. Уровни структуры белка
- 2. Проблема сворачивания
- 3. Как определяют структуру экспериментально
- 4. Соревнование CASP
- 5. Как работает AlphaFold 2
- 6. AlphaFold 3: комплексы молекул
- 7. Чего AlphaFold не умеет
- 8. Применение и конструирование белков
- 9. Для олимпиад
- Задания с разбором
1. Уровни структуры белка
| Уровень | Что это | Какие связи удерживают |
|---|---|---|
| Первичная | Последовательность аминокислот в цепи | Пептидные (ковалентные) связи |
| Вторичная | Местные регулярные укладки цепи: α-спираль, β-слой | Водородные связи между группами C=O и N−H остова цепи |
| Третичная | Пространственная укладка всей цепи | Взаимодействия боковых групп: гидрофобные, водородные, ионные связи, дисульфидные мостики |
| Четвертичная | Объединение нескольких цепей (субъединиц) | Те же, что в третичной |
В водной среде гидрофобные боковые группы стремятся спрятаться внутрь молекулы, а заряженные и полярные — оказаться на поверхности. Это главная «движущая сила» сворачивания. Функционирует белок в определённой пространственной форме (нативной конформации): форма активного центра фермента, участок связывания рецептора, канал в мембране. При денатурации форма теряется — и функция тоже (подробнее — в уроке «Белки: структура и функции»).
2. Проблема сворачивания
В 1961 году Кристиан Анфинсен показал на ферменте рибонуклеазе: если денатурировать белок (разрушить пространственную структуру мочевиной и восстановителем), а затем убрать эти вещества, белок сам сворачивается в правильную форму и восстанавливает активность. Вывод (Нобелевская премия 1972 года): вся информация о пространственной структуре белка заключена в его первичной структуре. Значит, в принципе, структуру можно вычислить по последовательности.
Но как? В 1969 году Сайрус Левинталь оценил число возможных форм цепи: если каждая аминокислота может принимать хотя бы 3 положения, у белка из 100 аминокислот около 3100 ≈ 1047 вариантов. Перебирая их со скоростью триллион в секунду, белок искал бы нужную форму дольше возраста Вселенной, а на деле сворачивается за миллисекунды — секунды (парадокс Левинталя). Значит, сворачивание идёт не перебором, а по «воронке» энергии: сначала быстро образуются местные элементы, затем они собираются, и каждый шаг понижает энергию.
Большой вклад в понимание сворачивания внесли отечественные биофизики Олег Борисович Птицын и Алексей Витальевич Финкельштейн (Институт белка РАН, Пущино). Птицын описал промежуточное состояние белка — «расплавленную глобулу»: цепь уже компактна и имеет вторичную структуру, но боковые группы ещё подвижны и не уложены окончательно.
Вычислять сворачивание методами физики (моделируя движение каждого атома) очень трудно: нужны огромные вычисления, а небольшие ошибки в описании сил накапливаются. Поэтому несколько десятилетий точность предсказаний оставалась низкой.
3. Как определяют структуру экспериментально
| Метод | Суть | Особенности |
|---|---|---|
| Рентгеноструктурный анализ | Белок выращивают в виде кристалла и изучают рассеяние рентгеновских лучей | Высокая точность; нужны кристаллы, которые получить трудно |
| Ядерный магнитный резонанс | Изучают поведение ядер атомов белка в растворе в магнитном поле | Белок в растворе, видна подвижность; подходит для небольших белков |
| Криоэлектронная микроскопия | Замороженные молекулы фотографируют в электронном микроскопе, сотни тысяч изображений объединяют | Подходит для крупных комплексов; без кристаллов; Нобелевская премия 2017 года |
Первые структуры белков (миоглобин и гемоглобин) получили Джон Кендрю и Макс Перуц в 1958–1960 годах. К 2020 году в мировом банке данных белковых структур было около 170 тысяч структур, на определение каждой нередко уходили годы. А последовательностей белков, известных по геномам, — сотни миллионов. Разрыв между известными последовательностями и известными структурами огромен.
4. Соревнование CASP
С 1994 года каждые два года проводится соревнование CASP (критическая оценка предсказания структур белков). Организаторы дают участникам последовательности белков, структуры которых уже определены экспериментально, но ещё не опубликованы. Участники присылают предсказания, а затем их сравнивают с экспериментом. Точность оценивают по шкале от 0 до 100; результаты выше 90 считаются сравнимыми с экспериментом.
До 2018 года лучшие результаты для трудных белков были около 40–60. В 2018 году первая версия AlphaFold заняла первое место, а в 2020 году AlphaFold 2 показал медианную точность около 92 — на уровне экспериментальных методов. Организаторы соревнования заявили, что проблема предсказания структуры отдельных белков в основном решена.
5. Как работает AlphaFold 2
AlphaFold 2 — нейронная сеть, обученная на известных структурах из банка данных. Важно понимать, на какую биологическую идею она опирается.
- Множественное выравнивание последовательностей. Для белка находят его родственников (гомологи) у множества организмов и выстраивают их последовательности друг под другом.
- Совместная изменчивость (коэволюция). Если две аминокислоты в белке соприкасаются, то мутация в одной часто должна компенсироваться мутацией в другой, чтобы белок сохранил форму. Поэтому соприкасающиеся положения изменяются в эволюции согласованно. Анализируя тысячи родственных последовательностей, можно найти такие пары и понять, какие участки цепи находятся рядом в пространстве.
- Модуль «внимания». Нейросеть одновременно анализирует выравнивание и таблицу попарных расстояний между аминокислотами, многократно уточняя одно по другому.
- Построение структуры. По уточнённым данным сеть строит трёхмерную модель и для каждого участка оценивает свою уверенность.
В 2021 году вместе с Европейским институтом биоинформатики была создана открытая база предсказанных структур, в которую вошли более 200 миллионов белков — почти все известные белки живых организмов.
6. AlphaFold 3: комплексы молекул
В клетке белки работают не поодиночке: они связываются с другими белками, с ДНК и РНК, с ионами металлов и малыми молекулами (коферментами, гормонами, лекарствами). В мае 2024 года была представлена AlphaFold 3, предсказывающая структуру таких комплексов:
- белок — белок (например, антитело и антиген);
- белок — ДНК и белок — РНК (например, фактор транскрипции на промоторе);
- белок — малая молекула (лекарство в активном центре фермента);
- белки с химическими модификациями.
Главное изменение в устройстве — диффузионный модуль, похожий на нейросети, создающие изображения. Он начинает со случайного «облака» координат атомов и шаг за шагом «очищает» его от шума, пока не получится структура, согласованная с последовательностями молекул. По проверкам авторов, для комплексов белков с лекарственными молекулами AlphaFold 3 точнее, чем прежние программы стыковки молекул.
7. Чего AlphaFold не умеет
- Движение. AlphaFold даёт одну статичную структуру, а белки в работе меняют форму (фермент «закрывается» вокруг субстрата, канал открывается и закрывается). Предсказание всех состояний белка и переходов между ними остаётся трудной задачей.
- Неупорядоченные участки. Около трети белков человека содержат участки без постоянной структуры; AlphaFold показывает их как участки с низкой уверенностью.
- Последствия мутаций. Замена одной аминокислоты, разрушающая белок, часто почти не меняет предсказанную структуру: программа опирается на родственные последовательности и «знает», как должен выглядеть белок.
- Придуманные детали. Диффузионная модель иногда создаёт правдоподобные, но неверные структуры там, где данных мало. Поэтому предсказания проверяют экспериментом.
- Окружение. Влияние мембраны, pH, концентрации ионов, температуры учитывается лишь частично.
8. Применение и конструирование белков
- Понимание функций белков. По структуре можно предположить, где у белка активный центр, с чем он связывается.
- Разработка лекарств. Поиск молекул, подходящих к карману белка-мишени, — например, к белкам болезнетворных бактерий и паразитов.
- Экспериментальная структурная биология. Предсказанные модели помогают расшифровать данные рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии.
- Конструирование новых белков. Обратная задача: не «какую форму примет последовательность», а «какая последовательность даст нужную форму». Группа Дэвида Бейкера создаёт белки, которых нет в природе: связывающие вирусы, токсины, ферменты для новых реакций. Конструирование дополняет направленную эволюцию (см. статью «Направленная эволюция»).
Повторить строение белков можно в уроках «Белки: первичная структура», «Структура белка и ферменты» и в тренажёре по теме 2.2.
Частые ошибки. 1) «Вторичную структуру удерживают взаимодействия боковых групп» — водородные связи между группами остова (C=O и N−H). 2) «При денатурации разрушаются пептидные связи» — разрушается пространственная структура, первичная сохраняется. 3) «AlphaFold предсказывает движения белков» — он предсказывает статичную структуру.
9. Для олимпиад
Почему коэволюция указывает на контакты
Пусть в белке аминокислоты в положениях 25 и 80 соприкасаются: у одного вида там положительно заряженный лизин и отрицательно заряженная глутаминовая кислота, образующие ионную связь. Если мутация заменит лизин на глутаминовую кислоту, появятся два одинаковых заряда, отталкивающихся друг от друга, — белок станет неустойчивым, и такой организм будет отсеян отбором. Но если одновременно (или вскоре) положение 80 заменится на лизин, пара снова будет устойчивой. В выравнивании тысяч последовательностей такие согласованные замены видны как корреляция между положениями — признак контакта в пространстве.
Энергетическая воронка
Сворачивание описывают как движение по поверхности энергии, похожей на воронку: на верху — множество развёрнутых форм с высокой энергией, на дне — одна нативная форма. Белок не перебирает все формы, а «скатывается» по склонам, на каждом шаге уменьшая энергию и число возможных форм. Некоторые белки застревают в «ловушках» — неправильных формах; им помогают сворачиваться белки-шапероны. Неправильно свёрнутые белки могут образовывать агрегаты, как при болезнях, вызванных прионами (см. статью «Прионы»).
Задания с разбором
Сначала ответьте сами, затем откройте разбор.
Задание 1
Установите соответствие между уровнем структуры белка и связями, которые его поддерживают: А — первичная, Б — вторичная, В — третичная. Связи: 1) пептидные; 2) водородные между группами остова; 3) дисульфидные мостики между остатками цистеина; 4) гидрофобные взаимодействия боковых групп.
Разбор
1 — А, 2 — Б, 3 — В, 4 — В.
Задание 2
Опишите опыт Анфинсена и сделайте из него вывод.
Разбор
1) Рибонуклеазу денатурировали мочевиной и восстановителем, разрывающим дисульфидные мостики; белок потерял пространственную структуру и активность. 2) После медленного удаления этих веществ белок сам свернулся и восстановил активность. 3) Вывод: пространственная структура белка определяется его первичной структурой.
Задание 3
В чём заключается парадокс Левинталя? Как он разрешается?
Разбор
1) Число возможных форм цепи астрономически велико (около 1047 для белка из 100 аминокислот), и перебор занял бы больше времени, чем возраст Вселенной. 2) Но белки сворачиваются за доли секунды. 3) Значит, сворачивание идёт не перебором, а направленно: быстро образуются местные элементы вторичной структуры, гидрофобные группы собираются в ядро, и энергия на каждом шаге уменьшается («воронка»).
Задание 4
Почему важно было создать программы предсказания структуры, если её можно определить экспериментально?
Разбор
1) Экспериментальное определение структуры дорого и занимает месяцы и годы; для многих белков не удаётся получить кристаллы. 2) Последовательностей, известных по геномам, — сотни миллионов, а экспериментальных структур — около двухсот тысяч. 3) Предсказание позволяет получить модели почти всех белков и выбрать, какие изучать экспериментально.
Задание 5
Какую информацию AlphaFold 2 извлекает из сравнения последовательностей родственных белков разных организмов?
Разбор
1) Консервативные положения, важные для структуры и функции. 2) Пары положений, изменяющихся согласованно (коэволюция); они, скорее всего, соприкасаются в пространстве. 3) По набору таких пар сеть оценивает расстояния между участками цепи и строит трёхмерную модель.
Задание 6 (олимпиадное)
У пациента обнаружена замена одной аминокислоты в ферменте, и фермент не работает. AlphaFold предсказывает для мутантного белка почти такую же структуру, как для нормального. Объясните противоречие. Какие эксперименты помогли бы выяснить причину нарушения?
Разбор
1) AlphaFold опирается на родственные последовательности и обучение на устойчивых белках и плохо учитывает влияние одиночных замен на устойчивость. 2) Мутация может снижать устойчивость (белок сворачивается неправильно или быстро разрушается), нарушать работу активного центра (замена каталитической аминокислоты) или подвижность белка, не меняя заметно статичную структуру. 3) Эксперименты: измерить количество белка в клетке, его термостабильность, активность очищенного фермента, определить структуру экспериментально.
Литература
- Anfinsen C. B. Principles that govern the folding of protein chains // Science. 1973. Vol. 181. P. 223–230.
- Jumper J. et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold // Nature. 2021. Vol. 596. P. 583–589.
- Abramson J. et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3 // Nature. 2024. Vol. 630. P. 493–500.
- Финкельштейн А. В., Птицын О. Б. Физика белка. — М.: КДУ.
Обсуждение
Загружаем обсуждение…