Методы молекулярной и клеточной биологии (метод меченых атомов, хроматография, электрофорез)

6 терминов · 7 заданий

Метод	Суть и что позволяет увидеть или разделить
Световая микроскопия	Живые и фиксированные клетки, цветное изображение, увеличение до ~2000×. Видны ядро, хлоропласты, вакуоли, клеточная стенка, деление клетки, движение цитоплазмы.
Электронная микроскопия	Пучок электронов вместо света; только фиксированные (мёртвые) объекты, чёрно-белое изображение, увеличение до сотен тысяч раз. Видна ультраструктура: рибосомы, мембраны, кристы митохондрий, вирусы.
Дифференциальное центрифугирование	Разрушенные клетки вращают в центрифуге с нарастающей скоростью: структуры оседают по плотности и массе — сначала ядра, затем пластиды и митохондрии, потом рибосомы. Позволяет выделить органоиды для изучения.
Метод меченых атомов	В вещество вводят изотоп — радиоактивный (¹⁴C, ³H, ³²P, ³⁵S) или тяжёлый стабильный (¹⁵N, ¹⁸O) — и прослеживают его путь в реакциях обмена: радиоактивную метку выявляют радиоавтографией, тяжёлую стабильную — масс-спектрометрией или по плотности молекул. Так доказали, что O₂ при фотосинтезе выделяется из воды (метка ¹⁸O), а ДНК фага проникает в бактерию (метка ³²P).
Хроматография	Разделение смеси веществ по скорости их движения в адсорбенте (бумага, гель): пигменты листа расходятся полосками (хлорофиллы a и b, каротиноиды).
Электрофорез	Разделение заряженных молекул (белков, фрагментов ДНК) в электрическом поле по размеру и заряду; основа ДНК-идентификации.
Культивирование клеток	Выращивание клеток и тканей вне организма на питательной среде: изучение деления, действия веществ, получение вакцин, клонирование растений.
Микрохирургия	Пересадка ядра, удаление органоидов (опыты с ацетабулярией показали роль ядра).

Как выбрать метод. «Разделить органоиды» → центрифугирование; «проследить путь вещества» → меченые атомы; «разделить пигменты/смесь веществ» → хроматография; «разделить белки или фрагменты ДНК» → электрофорез; «увидеть рибосомы, вирусы» → электронный микроскоп; «увидеть живую клетку в цвете» → световой микроскоп.

Метод	Что даёт	Пример результата
Световая микроскопия	Увеличение до 2000×, разрешение ≈ 0,2 мкм; видны клетки, ядро, хлоропласты, хромосомы при делении	Подсчёт хромосом, наблюдение за делением живой клетки
Электронная микроскопия	Увеличение в сотни тысяч раз, разрешение до долей нанометра; препарат фиксированный, не живой	Открытие рибосом, крист митохондрий, строения мембран и вирусов
Дифференциальное центрифугирование	Разделение органоидов по плотности и массе после разрушения клеток	Фракция митохондрий для изучения дыхания отдельно от клетки
Метод меченых атомов	Прослеживание судьбы вещества по радиоактивной или тяжёлой метке	Опыт Мезельсона и Сталя: репликация ДНК полуконсервативна
Хроматография и электрофорез	Разделение смеси веществ (пигментов, белков, фрагментов ДНК)	Разделение хлорофиллов a и b и каротиноидов; ДНК-профиль
Культура клеток и тканей	Выращивание клеток вне организма на питательной среде	Испытание лекарств, получение вакцин, клеточная инженерия
Микроскопическая техника окрашивания	Контрастирование структур красителями и флуоресцентными метками	Выявление хромосом (кариотип), локализация белка в клетке

Почему методы дополняют друг друга. Микроскопия показывает, как расположены структуры, но не говорит, что они делают; центрифугирование выделяет органоид, но лишает его окружения; меченые атомы прослеживают процесс, но не показывают картинку. Поэтому вывод о функции органоида делают, сопоставляя данные нескольких методов: например, роль митохондрий в дыхании доказана и наблюдением крист под электронным микроскопом, и измерением поглощения кислорода выделенной фракцией.

Как работает метод меченых атомов. Изотоп химически ведёт себя так же, как обычный атом того же элемента, поэтому клетка включает его в те же реакции. Радиоактивную метку находят по излучению — счётчиком или радиоавтографией (срез покрывают фотоэмульсией, и она засвечивается там, где лежит метка); тяжёлую стабильную — масс-спектрометрией (по массе молекул) или по плотности: «тяжёлая» ДНК с ¹⁵N оседает при центрифугировании ниже «лёгкой». Классические опыты: вода с ¹⁸O показала, что кислород фотосинтеза происходит из воды; CO₂ с ¹⁴C позволил М. Кальвину проследить путь углерода в темновой фазе; ³²P и ³⁵S в опыте А. Херши и М. Чейз доказали, что в бактерию проникает ДНК фага, а не его белок; ¹⁵N в опыте М. Мезельсона и Ф. Сталя — что репликация ДНК полуконсервативна; ³H-тимидин отмечает клетки, которые удваивают ДНК.

Хроматография (от греч. chroma — цвет) предложена русским ботаником М. С. Цветом в 1903 г. для разделения пигментов листа. Смесь движется вместе с растворителем (подвижная фаза) по бумаге, тонкому слою сорбента или колонке с гелем (неподвижная фаза). Вещества, которые сильнее удерживаются сорбентом и хуже растворяются в растворителе, отстают, и смесь расходится на отдельные зоны: из пигментов листа быстрее всех движется жёлто-оранжевый каротин. Этим методом очищают белки, разделяют аминокислоты, сахара, гормоны, определяют состав смесей.

Маркеры ЕГЭ. «Нужно увидеть рибосомы, мембраны, вирус» → электронный микроскоп; «наблюдать деление живой клетки» → световой; «выделить митохондрии» → центрифугирование; «проследить путь вещества» → меченые атомы; «разделить пигменты листа» → хроматография; «метка ¹⁵N или ¹⁸O» → тяжёлый стабильный изотоп (масс-спектрометрия, плотность), «¹⁴C, ³H, ³²P, ³⁵S» → радиоактивный (радиоавтография); «объёмное изображение поверхности клетки» → сканирующий электронный микроскоп; «фрагменты ДНК разошлись в геле по длине» → электрофорез; «каллус, микроклональное размножение» → культура растительных тканей.

Нюансы. Разрешение микроскопа ограничено длиной волны: световым микроскопом рибосому не увидеть ни при каком увеличении. Электронная микроскопия работает в вакууме и с фиксированным препаратом — «живые» процессы ею не наблюдают. Увеличение и разрешение — разные величины: бессмысленное увеличение («пустое») не добавляет деталей. Метка в методе меченых атомов не обязательно радиоактивна: ¹⁵N и ¹⁸O стабильны и отличаются от обычных атомов только массой. В электрофорезе ДНК движется к положительному электроду, потому что заряжена отрицательно.

Метод	Суть и что позволяет увидеть или разделить
Электрофорез	Разделение заряженных молекул (белков, фрагментов ДНК) в электрическом поле по размеру и заряду; основа ДНК-идентификации.
Культивирование клеток	Выращивание клеток и тканей вне организма на питательной среде: изучение деления, действия веществ, получение вакцин, клонирование растений.

Метод	Что даёт	Пример результата
Хроматография и электрофорез	Разделение смеси веществ (пигментов, белков, фрагментов ДНК)	Разделение хлорофиллов a и b и каротиноидов; ДНК-профиль
Культура клеток и тканей	Выращивание клеток вне организма на питательной среде	Испытание лекарств, получение вакцин, клеточная инженерия

Электрофорез.

Культивирование клеток и тканей. Клетки выделяют из организма и выращивают в стерильных условиях в питательной среде (соли, глюкоза, аминокислоты, витамины; для клеток животных — ещё сыворотка крови с факторами роста) при постоянной температуре. Кусочек растительной ткани на среде с фитогормонами (ауксинами и цитокининами) образует каллус — массу недифференцированных делящихся клеток, из которых можно вырастить целое растение; на этом основано микроклональное размножение, а культура верхушечной меристемы даёт безвирусный посадочный материал. Культуры клеток человека и животных нужны для выращивания вирусов и производства вакцин, испытания лекарств, изучения деления клеток и опухолевого роста.

Закрепите теорию: 6 терминов и 7 заданий с проверкой и подсказками, урок зачитывается от 70 %.

Пройти урок arrow_forward