Цитогенетический и молекулярно-генетический методы: от кариотипа до секвенирования генома

Родословная подсказывает, как наследуется болезнь, близнецы — насколько велика роль генов. Но чтобы поставить точный диагноз, нужно заглянуть в сами хромосомы и ДНК. Этим заняты цитогенетический и молекулярно-генетический методы — от подсчёта хромосом под микроскопом до прочтения всех трёх миллиардов нуклеотидов генома.

Это четвёртая статья серии «Генетика человека». В ней — как устроены и что «видят» классическое кариотипирование, флуоресцентная гибридизация и хромосомный микроматричный анализ; как работает ПЦР и что такое ПЦР-анализ; чем генотипирование отличается от секвенирования; как читают экзом и геном и как толкуют найденные варианты; где эти методы применяют — в диагностике, при беременности, в криминалистике, при подборе лекарств. В конце — сравнительная таблица методов, задания ЕГЭ и олимпиад.

• 1. Зачем нужны лабораторные методы
• 2. Цитогенетический метод
• 3. Флуоресцентная гибридизация (FISH)
• 4. Хромосомный микроматричный анализ
• 5. Как развивалась цитогенетика человека
• 6. Молекулярно-генетический метод: общие приёмы
• 7. Полимеразная цепная реакция
• 8. ПЦР-анализ: что с его помощью узнают
• 9. Как устроен ПЦР-тест на инфекцию
• 10. Генотипирование и секвенирование: в чём разница
• 11. Секвенирование в медицине
• 12. Как работает секвенирование нового поколения
• 13. Как понять, вредна ли найденная мутация
• 14. Гены и лекарства
• 15. Не только последовательность: метилирование и РНК
• 16. Где применяют методы
• 17. Сравнение методов
• 18. Этика генетического тестирования
• 19. Как выбирают метод: три случая
• 20. Итог: что важно знать
• 21. Частые ошибки
• 22. Интересные факты
• 23. Частые вопросы
• 24. ЕГЭ
• 25. Для олимпиад
• 26. Задания с разбором
• Литература

1. Зачем нужны лабораторные методы

Генеалогический, близнецовый и популяционно-статистический методы работают с фенотипами — с тем, болен человек или здоров, высокий он или низкий. Генотип они позволяют определить лишь косвенно, с некоторой вероятностью: «носитель с вероятностью 2/3». Лабораторные методы изучают сам наследственный материал и дают прямой ответ.

Их можно расположить по «разрешающей способности» — по тому, насколько мелкие изменения они способны заметить:

• микроскоп и окраска хромосом — изменения размером в миллионы пар нуклеотидов (целые хромосомы и их крупные участки);
• флуоресцентная гибридизация и микроматрицы — сотни тысяч и десятки тысяч пар нуклеотидов;
• ПЦР и секвенирование — отдельные нуклеотиды.

Не существует одного метода, который видит всё. Классический кариотип хорошо показывает сбалансированную транслокацию, но не видит замену одного нуклеотида; секвенирование экзома находит такую замену, но может пропустить транслокацию. Поэтому генетик выбирает метод под вопрос: какую болезнь он подозревает и какой тип мутации вероятен.

Методы различаются и по тому, что служит материалом. Для кариотипа нужны живые делящиеся клетки — обычно лимфоциты крови, при беременности — клетки околоплодных вод или ворсин хориона. Для анализа ДНК подходит почти любой материал с ядрами клеток: кровь, слюна, соскоб со щеки, волосяные луковицы, ткань опухоли, даже высохшее пятно крови на карточке скрининга новорождённых или древние кости.

2. Цитогенетический метод

Как получают кариотип и как его записывают, подробно рассказано в статье «Кариотип человека и программа «Геном человека»». Кратко: лимфоциты крови стимулируют к делению, останавливают деление в метафазе колхицином, обрабатывают гипотоническим раствором, фиксируют, окрашивают дифференциальной окраской и упорядочивают хромосомы в кариограмму.

Что выявляет метод

• Анеуплоидии — изменение числа отдельных хромосом: трисомии 21, 18, 13 (синдромы Дауна, Эдвардса, Патау), анеуплоидии по половым хромосомам (45,X; 47,XXY; 47,XXX; 47,XYY).
• Полиплоидии — например, триплоидию 69,XXY у плода.
• Крупные структурные перестройки — делеции, дупликации, инверсии, транслокации, кольцевые хромосомы, если они затрагивают участки длиной от нескольких миллионов пар нуклеотидов.
• Мозаицизм — если просмотреть достаточно клеток (обычно 20–30, при подозрении на мозаицизм — больше).
• Изменения кариотипа опухолевых клеток, например филадельфийскую хромосому при хроническом миелоидном лейкозе.

Когда назначают

Исследование кариотипа назначают при подозрении на хромосомный синдром у ребёнка, при множественных пороках развития, при бесплодии и повторных выкидышах у супругов (чтобы найти сбалансированную перестройку), при нарушениях полового развития, а также при некоторых опухолях крови.

Исследование полового хроматина

Самый простой цитогенетический тест — подсчёт телец Барра в клетках буккального эпителия (соскоба со внутренней стороны щеки). Число телец Барра на единицу меньше числа X-хромосом: у женщины 46,XX — одно тельце, у мужчины 46,XY — ни одного, при 47,XXY — одно, при 45,X — ни одного. Тест быстрый и дешёвый, и раньше его широко применяли для предварительной оценки числа X-хромосом. Сегодня его вытеснили более точные методы, но в задачах ЕГЭ он встречается постоянно.

Ограничения

Нужны живые делящиеся клетки и несколько дней на выращивание культуры. Разрешение ограничено — около 5–10 миллионов пар нуклеотидов на обычном препарате. Анализ требует опытного цитогенетика и остаётся отчасти субъективным. Генные мутации метод не выявляет.

3. Флуоресцентная гибридизация (FISH)

В 1980-х гг. цитогенетика соединилась с молекулярной биологией. Появился метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH, от англ. fluorescence in situ hybridization) [1].

Принцип

1. Готовят зонд — фрагмент ДНК, комплементарный изучаемому участку хромосомы, и метят его флуоресцентным красителем.
2. Хромосомы на препарате (или ядра интерфазных клеток) обрабатывают так, чтобы двойная спираль ДНК разошлась на одиночные цепи.
3. Зонд наносят на препарат. Он находит комплементарную последовательность и соединяется с ней по принципу комплементарности — гибридизуется. Слова «in situ» означают «на месте»: гибридизация идёт прямо в хромосоме или ядре.
4. Препарат рассматривают в флуоресцентном микроскопе: на месте участка видна светящаяся точка.

Что выявляет

• Микроделеции, невидимые при обычной окраске. Если зонд к участку 22q11.2 светится только на одной из двух 22-х хромосом, у человека делеция этого района — синдром Ди Джорджи (пороки сердца, нарушения иммунитета и развития нёба). Аналогично выявляют делецию 7q11.23 при синдроме Вильямса.
• Число хромосом в интерфазных ядрах. Зонды к хромосомам 13, 18, 21, X и Y, окрашенные в разные цвета, позволяют за один-два дня, без выращивания культуры, посчитать эти хромосомы в клетках околоплодных вод: три точки зонда к 21-й хромосоме — трисомия 21.
• Транслокации, особенно в опухолевых клетках: при хроническом миелоидном лейкозе зонды к генам BCR (22-я хромосома) и ABL1 (9-я) разного цвета в норме светятся отдельно, а при транслокации t(9;22) — сливаются в одну точку смешанного цвета.
• Происхождение «лишнего» материала: «раскрашивающие» зонды покрывают целую хромосому, и под микроскопом видно, из какой хромосомы взят перемещённый участок.

Развитием метода стало спектральное кариотипирование: каждую из 24 разных хромосом человека (22 аутосомы, X и Y) окрашивают собственной комбинацией красителей, и компьютер раскрашивает кариограмму в 24 цвета. Это позволяет разобраться в сложных перестройках опухолевых клеток.

Ограничения

FISH отвечает только на заданный вопрос: зонд показывает лишь тот участок, к которому он сделан. Чтобы найти делецию, надо заранее подозревать, где она. Для поиска «вслепую» по всему геному нужен другой подход — микроматрицы.

4. Хромосомный микроматричный анализ

Хромосомный микроматричный анализ (ХМА) проверяет одновременно сотни тысяч или миллионы участков генома и находит, где ДНК «не хватает» или «слишком много».

Принцип

Микроматрица (микрочип) — стеклянная пластинка, на которой в строгом порядке закреплены миллионы коротких зондов, каждый к своему участку генома. ДНК пациента метят флуоресцентной меткой и наносят на чип. Чем больше копий участка в ДНК пациента, тем ярче светится соответствующая точка. Компьютер сравнивает яркость с эталоном и строит «карту доз» для каждой хромосомы. Различают два типа чипов: со сравнительной гибридизацией (ДНК пациента и эталонная ДНК метят разными красителями и смешивают) и SNP-чипы, которые одновременно определяют генотип по сотням тысяч однонуклеотидных вариантов.

Что выявляет

• Делеции и дупликации от десятков тысяч пар нуклеотидов — в сто раз мельче, чем видно в микроскоп.
• Все анеуплоидии и несбалансированные перестройки.
• SNP-чипы показывают и участки, где обе копии хромосомы одинаковы: так находят однородительскую дисомию и признаки близкого родства родителей.

С 2010 г. международные рекомендации считают ХМА исследованием первой линии для детей с задержкой развития, нарушениями интеллекта, аутизмом и множественными пороками: он находит причину примерно у 15–20 % таких детей, а обычный кариотип — лишь у 3 % [2].

Чего ХМА не видит

Метод чувствителен к количеству ДНК, но не к её расположению. Сбалансированные перестройки — реципрокные транслокации и инверсии, при которых ничего не теряется и не удваивается, — для ХМА невидимы. Поэтому при повторных выкидышах у супругов по-прежнему исследуют классический кариотип. Не видит ХМА и точечные мутации — для них нужны ПЦР и секвенирование.

5. Как развивалась цитогенетика человека

История цитогенетики человека удивительно коротка: от установления правильного числа хромосом до чтения генома прошло меньше полувека.

Филадельфийская хромосома: от микроскопа к лекарству

История одной хромосомной аномалии хорошо показывает, как цитогенетика привела к созданию лекарства. В 1960 г. в Филадельфии Питер Ноуэлл и Дэвид Хангерфорд заметили у больных хроническим миелоидным лейкозом необычно маленькую хромосому, которую назвали филадельфийской. Это была первая хромосомная аномалия, связанная с раком. В 1973 г. американский цитогенетик Джанет Роули с помощью новой дифференциальной окраски показала, что это не просто укороченная 22-я хромосома: её отсутствующий участок перенесён на 9-ю хромосому, а взамен 22-я получила маленький кусочек 9-й — реципрокная транслокация t(9;22) [3].

В 1980-х гг. выяснили, что в месте разрыва соединяются два гена — BCR с 22-й хромосомы и ABL1 с 9-й, и образуется гибридный ген. Его белок BCR-ABL1 — постоянно активный фермент тирозинкиназа, который непрерывно посылает клеткам сигнал делиться. Тогда учёные создали вещество, специально блокирующее этот фермент, — иматиниб. Клинические испытания 2001 г. показали поразительный результат: у подавляющего большинства больных картина крови нормализовалась [4]. Сегодня многие больные хроническим миелоидным лейкозом живут почти столько же, сколько здоровые люди.

Путь от наблюдения в микроскоп до лекарства занял 40 лет. Он стал образцом «таргетной» терапии — лечения, направленного на конкретное молекулярное нарушение в опухоли. А цитогенетика и молекулярная генетика стали обязательной частью диагностики опухолей крови: от найденных перестроек зависит выбор лечения и прогноз.

Хромосомы опухолей

В клетках многих злокачественных опухолей кариотип сильно изменён: число хромосом может составлять 60–90, встречаются многочисленные перестройки, утраты и удвоения участков. Это следствие нестабильности генома опухоли. Изучение повторяющихся перестроек помогло найти многие онкогены и гены-супрессоры опухолей. Так, при ретинобластоме в клетках опухоли часто утрачен участок 13q14 — там лежит ген RB1, первым открытый ген-супрессор опухолей.

6. Молекулярно-генетический метод: общие приёмы

Молекулярно-генетический метод — это не один приём, а целый набор технологий. Почти все они опираются на несколько основных операций.

Выделение ДНК

Клетки разрушают моющими средствами и ферментами, белки удаляют, а ДНК осаждают спиртом или связывают на специальных носителях. Из 1 мл крови получают несколько десятков микрограммов ДНК — более чем достаточно для любых анализов. Современные методы работают и с нанограммами ДНК — количеством, содержащимся в нескольких сотнях клеток.

Рестриктазы

Рестриктазы — бактериальные ферменты, разрезающие ДНК в строго определённых коротких последовательностях (сайтах рестрикции), например GAATTC. Если мутация создаёт или уничтожает такой сайт, длина фрагментов после разрезания меняется. Так в 1970–1980-х гг. впервые научились выявлять мутации прямо в ДНК — например, мутацию серповидноклеточной анемии, уничтожающую сайт одной из рестриктаз в гене β-глобина.

Электрофорез

Фрагменты ДНК разделяют по длине в геле под действием электрического тока. ДНК заряжена отрицательно (из-за остатков фосфорной кислоты) и движется к положительному электроду; короткие фрагменты проходят через поры геля быстрее длинных. Затем ДНК окрашивают, и в геле видны полосы. Сравнивая положение полос с «линейкой» из фрагментов известной длины, определяют размер фрагментов.

Гибридизация с зондами

В 1975 г. британский биохимик Эдвин Саузерн придумал способ найти нужный фрагмент среди миллионов: ДНК после электрофореза переносят на мембрану и обрабатывают меченым зондом, который связывается только с комплементарной последовательностью [5]. Этот метод назвали саузерн-блоттингом, а по аналогии появились «нозерн-блоттинг» для РНК и «вестерн-блоттинг» для белков — игра слов с фамилией автора («южный» по-английски — southern).

Принцип гибридизации — комплементарное связывание меченого зонда с нужной последовательностью — лежит в основе и FISH, и микроматриц, и многих вариантов ПЦР.

7. Полимеразная цепная реакция

Главная проблема ранних методов — нужного участка ДНК в образце слишком мало: один ген составляет миллионную долю генома. В 1983 г. американский биохимик Кэри Муллис придумал, как «размножить» нужный участок в пробирке. Метод назвали полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Первую практическую работу с ПЦР — диагностику серповидноклеточной анемии по гену β-глобина — опубликовали в 1985 г. [6]. В 1993 г. Муллис получил за ПЦР Нобелевскую премию по химии.

Что нужно для ПЦР

• Матрица — исследуемая ДНК.
• Праймеры — два коротких (около 20 нуклеотидов) одноцепочечных фрагмента ДНК, комплементарных концам нужного участка на противоположных цепях. Они определяют, какой участок будет размножен.
• ДНК-полимераза, устойчивая к нагреванию. Её взяли у бактерии Thermus aquaticus, живущей в горячих источниках, — Taq-полимераза [7].
• Нуклеотиды (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты) — «строительный материал».
• Буферный раствор с ионами магния.

Как проходит один цикл

1. Денатурация (около 95 °C): водородные связи между цепями разрываются, двойная спираль расходится на одиночные цепи.
2. Отжиг праймеров (обычно 50–65 °C): праймеры присоединяются к комплементарным участкам цепей.
3. Элонгация (около 72 °C): полимераза достраивает новые цепи, начиная от праймеров.

Каждый цикл занимает одну-две минуты и удваивает число копий участка. После n циклов из одной молекулы получается около 2ⁿ копий: после 30 циклов — около миллиарда. Весь процесс идёт в приборе-амплификаторе, который автоматически меняет температуру. Через пару часов нужного фрагмента становится так много, что его видно в геле.

Использование термостабильной полимеразы было ключевым: раньше полимеразу кишечной палочки, разрушавшуюся при каждом нагревании, приходилось добавлять в каждом цикле вручную.

8. ПЦР-анализ: что с его помощью узнают

Сама по себе ПЦР лишь размножает участок ДНК. Но вокруг неё построено множество диагностических методов — их называют ПЦР-анализом.

Есть ли в образце нужная ДНК

Если праймеры подобраны к ДНК определённого вируса или бактерии, продукт ПЦР образуется только тогда, когда этот возбудитель есть в образце. Так выявляют ВИЧ, вирусы гепатитов, возбудителей туберкулёза, коронавирус SARS-CoV-2. Для РНК-вирусов сначала проводят обратную транскрипцию — переписывают РНК в ДНК ферментом обратной транскриптазой (метод ОТ-ПЦР).

ПЦР в реальном времени

В современном варианте в реакцию добавляют флуоресцентные метки, свечение которых растёт по мере накопления продукта. Прибор измеряет флуоресценцию после каждого цикла. Чем больше было исходной ДНК, тем раньше свечение превысит пороговый уровень. Так можно не только обнаружить, но и измерить количество ДНК или РНК — например, вирусную нагрузку при ВИЧ-инфекции или долю опухолевых клеток при лейкозе.

Генотипирование по известной мутации

Если мутация известна, ПЦР позволяет быстро и дёшево определить генотип человека по ней. Примеры:

• Выпадение трёх нуклеотидов F508del в гене CFTR — самая частая мутация при муковисцидозе. Продукт ПЦР с мутантного аллеля на 3 нуклеотида короче, и это различие видно при электрофорезе высокого разрешения или с помощью меченых зондов.
• Аллель-специфичная ПЦР: праймер подбирают так, чтобы его последний нуклеотид совпадал только с нормальным или только с мутантным аллелем. Продукт образуется лишь при совпадении. Две реакции — с «нормальным» и «мутантным» праймером — дают генотип: только первая — гомозигота по норме, только вторая — гомозигота по мутации, обе — гетерозигота.
• Повторы нуклеотидов: длина продукта ПЦР показывает число повторов CAG в гене HTT при болезни Гентингтона или CGG в гене FMR1 при синдроме ломкой X-хромосомы.

Определение пола и анеуплоидий

Количественная ПЦР с маркерами разных хромосом позволяет быстро оценить их число — например, проверить трисомию 21 в клетках плода. По ДНК плода в крови матери ПЦР-методом определяют резус-фактор плода и его пол (при риске X-сцепленной болезни).

Генетическая «дактилоскопия»

В 1985 г. британский генетик Алек Джеффрис обнаружил, что некоторые повторяющиеся участки ДНК настолько различаются по длине у разных людей, что их рисунок уникален для каждого человека, кроме однояйцевых близнецов [8]. Он назвал это «генетическими отпечатками пальцев». Уже через год метод помог раскрыть убийство в Англии и оправдать невиновного подозреваемого.

Сегодня для идентификации личности одновременно размножают с помощью ПЦР 15–25 участков с короткими тандемными повторами (STR) и определяют длину каждого. Вероятность случайного совпадения всех участков у двух неродственных людей — меньше одной миллиардной. Тот же анализ устанавливает родство: ребёнок получает по одному аллелю каждого маркера от каждого родителя, и если у предполагаемого отца нет нужного аллеля по нескольким маркерам, отцовство исключено.

9. Как устроен ПЦР-тест на инфекцию

Самым известным применением ПЦР в последние годы стали тесты на коронавирус SARS-CoV-2. Уже в январе 2020 г., через несколько недель после того, как была опубликована последовательность генома нового вируса, немецкие вирусологи описали протокол его выявления методом ОТ-ПЦР в реальном времени [9]. На этом примере удобно разобрать весь путь анализа.

1. Взятие материала. Мазок из носоглотки и ротоглотки помещают в пробирку с консервирующим раствором. От качества мазка во многом зависит результат: если вирусных частиц в пробе мало, тест может их не обнаружить.
2. Выделение РНК. Вирусные частицы разрушают и выделяют нуклеиновые кислоты. Геном коронавируса — одноцепочечная РНК длиной около 30 тысяч нуклеотидов.
3. Обратная транскрипция. Фермент обратная транскриптаза строит по РНК вируса комплементарную цепь ДНК, так как ДНК-полимераза работает только с ДНК-матрицей.
4. ПЦР в реальном времени. Праймеры подобраны к участкам генома вируса, которых нет у человека и у других распространённых вирусов. В реакцию добавлен зонд с флуоресцентной меткой и «гасителем»: пока зонд цел, он не светится, а при синтезе новой цепи полимераза разрушает зонд, и метка начинает светиться.
5. Учёт результата. Прибор фиксирует цикл, на котором свечение превысило порог (пороговый цикл, Ct). Если свечение не появилось за 40–45 циклов, результат отрицательный. Чем меньше Ct, тем больше вирусной РНК было в пробе: разница в 3,3 цикла соответствует примерно десятикратной разнице количества (2^3,3 ≈ 10).
6. Контроли. В каждый анализ включают положительный контроль (заведомо содержащий нужную последовательность), отрицательный (вода) и внутренний контроль — ген человека, который должен быть в любом правильно взятом мазке. Если внутренний контроль не определился, мазок взят плохо, и результат недостоверен.

Почему тест бывает ложноотрицательным и ложноположительным

Ложноотрицательный результат возможен, если мазок взят неправильно, вируса ещё мало (в первые дни после заражения) или уже мало (на поздней стадии), если вирус мутировал в участке, к которому подобран праймер. Поэтому тесты обычно проверяют два-три участка генома. Ложноположительный результат чаще всего связан с загрязнением пробы продуктами предыдущих реакций — ведь ПЦР способна размножить даже несколько молекул. Против этого в лабораториях разделяют помещения для выделения, постановки реакции и анализа продуктов.

Чувствительность и специфичность

Качество любого диагностического теста описывают двумя показателями. Чувствительность — доля больных, у которых тест положителен (насколько хорошо тест находит болезнь). Специфичность — доля здоровых, у которых тест отрицателен (насколько редко тест «ошибается в другую сторону»). У хорошо поставленной ПЦР специфичность очень высока, а чувствительность зависит прежде всего от взятия материала.

Цифровая ПЦР

В цифровой ПЦР образец делят на десятки тысяч крошечных капель или ячеек, так что в каждой оказывается одна молекула ДНК или ни одной. После амплификации подсчитывают светящиеся ячейки — это прямо даёт число исходных молекул без сравнения с эталоном. Метод особенно хорош для поиска редких мутантных молекул среди множества нормальных — например, мутаций опухоли в крови или ДНК плода в крови матери.

10. Генотипирование и секвенирование: в чём разница

Кодификатор ЕГЭ называет два способа современного определения генотипа: полногеномное секвенирование и генотипирование, в том числе с помощью ПЦР-анализа. Различие между ними принципиальное.

• Генотипирование — определение того, какие аллели есть у человека в заранее выбранных позициях генома. Мы заранее знаем, где искать и какие варианты возможны, и проверяем только эти места.
• Секвенирование — прочтение последовательности нуклеотидов подряд: гена, набора генов, всех экзонов или всего генома. Оно находит и известные, и новые, никогда прежде не описанные варианты.

Можно сравнить это с проверкой книги. Генотипирование — это проверка нескольких тысяч заранее выбранных слов: правильно ли они напечатаны. Секвенирование — чтение книги целиком, при котором можно заметить любую опечатку.

Генотипирующие микрочипы

Самый массовый способ генотипирования — SNP-чипы, определяющие за один анализ генотип по 500 тысячам — 2 миллионам однонуклеотидных вариантов. На этом основаны:

• полногеномный поиск ассоциаций — сравнение частот вариантов у больных и здоровых;
• генетические тесты для широкой публики, которые по слюне сообщают о происхождении и некоторых признаках;
• полигенные оценки риска;
• генетическая генеалогия — поиск родственников по совпадающим участкам генома.

Достоинство чипов — дешевизна: анализ стоит в десятки раз меньше полного секвенирования генома. Недостаток — они проверяют только заранее выбранные, в основном частые варианты. Редкие мутации, вызывающие тяжёлые наследственные болезни, чипы часто пропускают, а иногда и выдают ложные находки. Поэтому результат «чипа» о мутации, например в гене BRCA1, перед любым медицинским решением подтверждают секвенированием.

11. Секвенирование в медицине

Как прочитать ДНК, рассказано в статье о программе «Геном человека»: метод Сэнгера, основанный на обрыве цепи меченными нуклеотидами, и методы нового поколения, читающие миллионы фрагментов одновременно. Здесь — о том, как эти методы применяют в диагностике.

Почему так популярен экзом? Хотя он составляет лишь 1–2 % генома, именно в нём находится большинство известных мутаций, вызывающих менделевские болезни. Секвенирование экзома позволяет за один анализ проверить сразу все гены — а значит, найти причину болезни, даже если врач не догадывался, какой ген виноват.

Насколько это эффективно? Анализ десятков исследований показал: у детей с подозрением на наследственную болезнь секвенирование экзома или генома находит причину примерно в 30–40 % случаев — больше, чем любой другой отдельный метод [10]. У новорождённых в реанимации полногеномное секвенирование иногда выполняют за несколько дней, и результат прямо меняет лечение.

Трио

Часто секвенируют не только ребёнка, но и обоих родителей — так называемое трио. Это сразу показывает, какие варианты ребёнок унаследовал, а какие возникли заново. Новые мутации (de novo) — одна из главных причин тяжёлых нарушений развития у детей здоровых родителей. Без генотипов родителей их трудно отличить от безвредных семейных вариантов.

Длинные прочтения

Методы, читающие фрагменты длиной десятки тысяч нуклеотидов, позволяют находить то, что пропускают короткие прочтения: крупные перестройки, длинные повторы (например, при миотонической дистрофии), участки генов, похожих на псевдогены. Их всё шире применяют в диагностике.

12. Как работает секвенирование нового поколения

Чтобы понимать, что может и чего не может современное секвенирование, полезно знать, как оно устроено. Самый распространённый подход — секвенирование путём синтеза на проточной ячейке [11].

1. Подготовка библиотеки. ДНК пациента разрезают на фрагменты длиной несколько сотен нуклеотидов. К концам каждого фрагмента пришивают адаптеры — короткие известные последовательности. Для секвенирования экзома фрагменты, содержащие экзоны, сначала «вылавливают» с помощью зондов, комплементарных экзонам; остальные фрагменты отмывают.
2. Образование кластеров. Фрагменты наносят на стеклянную пластинку — проточную ячейку, поверхность которой покрыта короткими ДНК, комплементарными адаптерам. Каждый фрагмент прикрепляется в своей точке и размножается на месте, образуя кластер — пятно из тысяч одинаковых копий. На одной ячейке — сотни миллионов и миллиарды кластеров.
3. Секвенирование путём синтеза. В ячейку добавляют полимеразу и четыре вида нуклеотидов, каждый с флуоресцентной меткой своего цвета и с химической «заглушкой», которая не даёт присоединить следующий нуклеотид. В каждом кластере достраивается ровно один нуклеотид. Камера фотографирует ячейку: цвет каждого пятна показывает, какой нуклеотид присоединился. Затем метку и заглушку отщепляют, и цикл повторяется. За 150 циклов читают фрагмент длиной 150 нуклеотидов — сразу во всех кластерах.
4. Выравнивание. Компьютер находит для каждого из сотен миллионов прочтений место в эталонном геноме, где оно подходит лучше всего.
5. Поиск вариантов. В каждой позиции сравнивают все прочтения с эталоном. Если половина прочтений показывает в позиции Т вместо Ц, человек гетерозиготен по этой замене; если все — гомозиготен. Чтобы отличить настоящий вариант от ошибки, каждую позицию читают много раз: для генома — обычно 30 раз (покрытие 30×), для экзома — 100 раз и больше.

Нанопоры и одиночные молекулы

Методы третьего поколения читают одиночные молекулы ДНК без размножения. В нанопоровом секвенировании цепь ДНК протягивается через крошечное отверстие — белковую пору в мембране. Каждый нуклеотид по-своему меняет ток ионов через пору, и по изменению тока определяют последовательность. Так читают молекулы длиной в десятки и сотни тысяч нуклеотидов, а прибор размером с телефон можно взять в экспедицию: так в 2014–2016 гг. прямо в Западной Африке прослеживали распространение вируса Эбола. Нанопоры распознают и метилированные нуклеотиды — то есть позволяют одновременно читать и последовательность, и эпигенетические пометки.

Что трудно прочитать

• Длинные повторы — короткие прочтения не позволяют посчитать их число.
• Участки, почти одинаковые в нескольких местах генома (гены и их псевдогены), — прочтение не удаётся однозначно поставить на место.
• Участки с очень высоким содержанием Г–Ц, которые плохо размножаются.
• Сбалансированные перестройки — если точки разрыва попадают в повторы.

Поэтому, несмотря на огромные возможности, отрицательный результат секвенирования не означает, что мутации нет: она могла оказаться там, где метод «слеп».

13. Как понять, вредна ли найденная мутация

Прочитать геном сегодня проще, чем понять его. У каждого человека по сравнению с эталонным геномом около 4–5 миллионов вариантов, из них в экзоме — десятки тысяч, а редких, ранее не описанных вариантов в кодирующих участках — несколько сотен. Подавляющее большинство из них безвредны. Задача генетика — найти среди них тот единственный, что вызывает болезнь.

Для этого варианты классифицируют по международным рекомендациям на пять групп [12]:

Какие доводы учитывают

• Тип изменения. Вариант, создающий стоп-кодон или сдвиг рамки считывания в гене, где утрата функции вызывает болезнь, очень вероятно патогенен. Замена одной аминокислоты на похожую — гораздо менее определённа.
• Частота в популяции. Если вариант встречается у 5 % здоровых людей, он не может вызывать редкую тяжёлую болезнь. Поэтому базы данных с геномами сотен тысяч людей — главный инструмент толкования.
• Совпадение с болезнью в семье — генеалогический анализ: есть ли вариант у всех больных родственников и нет ли у здоровых.
• Происхождение: возник ли вариант заново у больного ребёнка здоровых родителей.
• Консервативность: если аминокислота одинакова у человека, рыб и дрожжей, её замена, скорее всего, вредна.
• Функциональные опыты: проверка работы белка с этой заменой в клетках или у модельных организмов.
• Компьютерные предсказания влияния замены на структуру белка.

Вариант неопределённого значения — частый и неприятный результат. Решения о лечении или о беременности по нему не принимают. Со временем, по мере накопления данных, многие такие варианты переклассифицируют — чаще в доброкачественные.

Случайные находки

Читая геном ради одной болезни, можно найти мутацию, указывающую на риск другой — например, наследственного рака или опасной аритмии. Такие случайные (вторичные) находки ставят этический вопрос: сообщать ли о них? Современная практика — заранее спросить человека, хочет ли он знать о находках, для которых существуют эффективная профилактика или лечение, и уважать его выбор.

14. Гены и лекарства

Одна и та же доза лекарства у одного человека действует хорошо, у другого не действует, а у третьего вызывает тяжёлую реакцию. Часть этих различий генетическая. Наука о том, как генотип влияет на действие лекарств, называется фармакогенетикой.

• Абакавир — лекарство против ВИЧ — у носителей аллеля HLA-B*57:01 вызывает опасную аллергическую реакцию. Исследование 2008 г. показало, что предварительное генотипирование и отказ от абакавира у носителей полностью предотвращают подтверждённые случаи этой реакции [13]. Сегодня тест обязателен перед назначением препарата.
• Клопидогрел, препятствующий образованию тромбов, превращается в активную форму ферментом CYP2C19. У людей с неактивными аллелями этого фермента лекарство почти не действует.
• Варфарин: необходимая доза зависит от вариантов генов CYP2C9 и VKORC1 и может различаться у разных людей в несколько раз.
• Противоопухолевые препараты подбирают по мутациям в клетках опухоли: например, иматиниб действует на белок BCR-ABL1, образующийся при транслокации t(9;22) при хроническом миелоидном лейкозе.
• Недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы: у её носителей некоторые противомалярийные препараты вызывают разрушение эритроцитов.

Фармакогенетика — один из примеров того, как молекулярно-генетический метод выходит за пределы наследственных болезней и становится частью повседневной медицины.

15. Не только последовательность: метилирование и РНК

Некоторые болезни вызывает не изменение последовательности ДНК, а нарушение её «пометок» или работы генов. Для них нужны особые методы.

Анализ метилирования

Метилирование цитозина — присоединение метильной группы к цитозину в сочетании ЦГ — выключает работу генов. Чтобы его обнаружить, ДНК обрабатывают бисульфитом натрия: неметилированный цитозин превращается в урацил (а после ПЦР — в тимин), а метилированный остаётся цитозином [14]. Сравнивая последовательность до и после обработки, определяют, какие цитозины были метилированы.

Анализ метилирования — главный способ диагностики синдромов Прадера — Вилли и Ангельмана. В районе 15q11–q13 часть генов работает только на отцовской хромосоме, а часть — только на материнской, и их копии различаются по метилированию. У здорового человека есть и «отцовский», и «материнский» рисунок метилирования. При синдроме Прадера — Вилли «отцовского» рисунка нет — из-за делеции на отцовской хромосоме, однородительской дисомии по материнской 15-й хромосоме или нарушения импринтинга. Один тест на метилирование выявляет все эти причины сразу; затем уточняют, какая из них действует, — от этого зависит риск для следующих детей.

Анализ РНК

Иногда мутация лежит в интроне и не меняет белок напрямую, но нарушает сплайсинг: в мРНК теряется экзон или появляется лишний участок. По одной ДНК предсказать это трудно. Тогда выделяют РНК из клеток больного (из крови, кожи или мышцы), переписывают её в ДНК обратной транскриптазой и секвенируют. Секвенирование РНК (транскриптома) показывает, какие гены работают, с какой активностью и как происходит сплайсинг. Добавление анализа РНК к секвенированию генома позволяет найти диагноз у части больных, у которых один геном ответа не дал.

Белки и обмен веществ

Многие наследственные болезни до сих пор выявляют не по ДНК, а по их биохимическим последствиям. Фенилкетонурию у новорождённых находят по повышенной концентрации фенилаланина в крови, муковисцидоз — по повышенному содержанию белка иммунореактивного трипсиногена в крови и затем по потовому тесту (у больных пот содержит много хлорида натрия). Биохимические методы дешёвые и быстрые, и именно они лежат в основе скрининга новорождённых. Молекулярные методы подтверждают диагноз и уточняют, какая мутация вызвала болезнь.

Соматические мутации и мозаицизм

Мутация может быть не во всех клетках, а лишь в части — например, только в коже или только в одной половине мозга. Тогда её не видно в ДНК из крови. Для поиска таких мутаций исследуют ткань из поражённого участка и секвенируют её с большим покрытием, чтобы заметить вариант, присутствующий, скажем, лишь в 5 % прочтений. Так нашли причину многих болезней с асимметричным разрастанием тканей и некоторых форм эпилепсии.

16. Где применяют методы

Диагностика наследственных болезней

Выбор метода зависит от того, что подозревает врач.

• Ребёнок с признаками синдрома Дауна — кариотип (он подтвердит трисомию и покажет, свободная она или транслокационная, что важно для риска повторения).
• Ребёнок с задержкой развития без ясного синдрома — хромосомный микроматричный анализ, затем секвенирование экзома или генома.
• Подозрение на муковисцидоз — анализ частых мутаций CFTR с помощью ПЦР, при необходимости — секвенирование всего гена.
• Подозрение на болезнь Гентингтона — определение числа повторов CAG в гене HTT.
• Подозрение на митохондриальную болезнь — анализ митохондриальной ДНК, причём часто не из крови, а из мышцы, где доля мутантных копий выше.

Носительство и планирование семьи

Родственников больного проверяют на найденную у него мутацию — это превращает вероятность «носитель с вероятностью 2/3» в точный ответ. В некоторых странах супругам перед беременностью предлагают расширенный скрининг носительства сразу сотен рецессивных болезней.

Пренатальная и предимплантационная диагностика

При известной мутации в семье её можно проверить у плода (в клетках ворсин хориона или околоплодных вод) или у эмбриона до переноса в матку при экстракорпоральном оплодотворении. В последнем случае от эмбриона на стадии бластоцисты берут несколько клеток наружного слоя, проводят ПЦР или секвенирование и переносят в матку эмбрион без мутации.

Скрининг новорождённых

Большинство болезней в программах скрининга выявляют биохимически — по концентрации веществ в капле крови. Но для некоторых, например спинальной мышечной атрофии и тяжёлых иммунодефицитов, применяют ПЦР: проверяют отсутствие гена SMN1 или особых кольцевых молекул ДНК, образующихся при созревании лимфоцитов.

Онкология

В опухоли ищут соматические мутации, от которых зависит выбор лечения. Всё чаще применяют «жидкую биопсию» — поиск фрагментов ДНК опухоли в крови: так можно следить за ответом на лечение и раньше заметить рецидив.

Криминалистика и установление личности

Анализ STR-маркеров позволяет установить, принадлежит ли биологический след подозреваемому, опознать погибших при катастрофах, установить отцовство и другое родство. Так же по ДНК опознали останки царской семьи и установили, что найденные в 2007 г. останки двух детей принадлежат цесаревичу Алексею и одной из великих княжон.

Наука

Молекулярно-генетические методы лежат в основе всей современной генетики: поиска генов болезней, изучения работы генов, эволюции и истории популяций, изучения древних геномов.

17. Сравнение методов

18. Этика генетического тестирования

Генетическая информация особенная. Она касается не только самого человека, но и его родственников; не меняется в течение жизни; может предсказывать болезни, которых ещё нет. Поэтому её использование регулируется особыми правилами.

• Добровольность и информированное согласие. Перед тестом человеку объясняют, что тест может показать, какие решения из этого последуют и какие возможны неопределённые результаты.
• Право не знать. Например, взрослый ребёнок больного болезнью Гентингтона может не захотеть узнать, унаследовал ли он мутацию: болезнь пока нельзя предотвратить. Такое решение уважают. Детей обычно не тестируют на болезни, начинающиеся во взрослом возрасте, если это не даёт пользы в детстве: пусть они решат сами, когда вырастут.
• Конфиденциальность. Генетические данные защищают особенно строго. Даже обезличенные геномы иногда можно связать с человеком, сравнив их с базами данных генетической генеалогии.
• Запрет дискриминации. Во многих странах законы запрещают работодателям и страховым компаниям использовать результаты генетических тестов.
• Информирование родственников. Если у человека найдена мутация, важная для родственников (например, в гене BRCA1), врач рекомендует ему сообщить им об этом, но решение остаётся за самим человеком.

Генетические тесты для широкой публики, которые продают через интернет, вызывают особые споры. Они дают интересные сведения о происхождении, но их медицинские выводы часто неполны, а иногда и ошибочны. Результаты, важные для здоровья, всегда нужно проверять в медицинской лаборатории и обсуждать с врачом-генетиком.

19. Как выбирают метод: три случая

Случай 1. Новорождённый с признаками синдрома Дауна

Врач видит у ребёнка характерные черты лица, сниженный мышечный тонус, порок сердца. Первым делом проводят быстрый анализ — FISH интерфазных ядер или количественную ПЦР с маркерами 21-й хромосомы: результат будет через один-два дня. Затем обязательно исследуют классический кариотип: он покажет, свободная ли это трисомия (47,XX,+21 или 47,XY,+21) или транслокационная (лишняя 21-я хромосома соединена с другой, например с 14-й). Во втором случае исследуют кариотипы родителей: если один из них — носитель сбалансированной транслокации, риск повторения в семье высокий, и это важно для планирования следующих беременностей.

Случай 2. Ребёнок с задержкой развития без явного синдрома

Мальчик трёх лет плохо говорит, у него порок сердца и частые инфекции. Явного синдрома врач не узнаёт. Первым назначают хромосомный микроматричный анализ — и он находит делецию около 3 миллионов пар нуклеотидов в районе 22q11.2. Это синдром Ди Джорджи, объясняющий и порок сердца, и иммунодефицит. Классический кариотип такую делецию бы не увидел. Затем проверяют родителей: чаще всего делеция возникает заново, но иногда её несёт один из родителей с лёгкими проявлениями — тогда риск для каждого следующего ребёнка 50 %.

Случай 3. Семья с наследственным раком

У женщины 35 лет рак молочной железы; у её матери был рак яичников, у тёти — рак молочной железы в 40 лет. Генеалогический анализ указывает на аутосомно-доминантную предрасположенность. Назначают секвенирование панели генов наследственного рака — и находят патогенную мутацию в гене BRCA1. Дальше — каскадное обследование: родственникам предлагают проверить только эту мутацию с помощью ПЦР и секвенирования по Сэнгеру. Сестра пациентки оказывается носительницей — ей рекомендуют регулярное обследование и обсуждают профилактические меры. Брат не носитель — его риск такой же, как у всех, и его дети мутацию не унаследуют.

Во всех трёх случаях видна общая логика: генеалогия и осмотр подсказывают гипотезу, лабораторный метод выбирают под тип предполагаемой мутации, а результат возвращают в родословную, чтобы оценить риск для родственников.

20. Итог: что важно знать

• Цитогенетический метод — изучение кариотипа под микроскопом; выявляет геномные мутации (анеуплоидии, полиплоидии) и крупные хромосомные перестройки, но не генные мутации.
• Тест на половой хроматин: число телец Барра на единицу меньше числа X-хромосом.
• FISH — гибридизация с флуоресцентными зондами; выявляет заданные микроделеции и транслокации, считает хромосомы в интерфазных ядрах.
• Хромосомный микроматричный анализ находит делеции и дупликации по всему геному, но не видит сбалансированных перестроек.
• Молекулярно-генетический метод — изучение ДНК и РНК: выделение ДНК, рестриктазы, электрофорез, гибридизация, ПЦР, секвенирование.
• ПЦР — многократное копирование участка ДНК: денатурация (≈ 95 °C), отжиг праймеров, элонгация (≈ 72 °C) термостабильной полимеразой; после n циклов ≈ 2ⁿ копий.
• Генотипирование определяет аллели в заранее выбранных позициях; секвенирование читает последовательность подряд и находит любые, в том числе новые, варианты.
• Секвенирование экзома и генома находит причину болезни примерно у трети детей с подозрением на наследственную болезнь.
• Найденные варианты классифицируют от патогенных до доброкачественных; варианты неопределённого значения не используют для медицинских решений.
• Методы применяют для диагностики, определения носительства, пренатальной и предимплантационной диагностики, в онкологии, фармакогенетике и криминалистике.

21. Частые ошибки

• «Цитогенетическим методом выявляют фенилкетонурию». Фенилкетонурия — генная болезнь, мутация не видна в микроскоп. Её выявляют биохимически (скрининг новорождённых) и молекулярно-генетически.
• «Синдром Дауна определяют генеалогическим методом». Синдром Дауна — хромосомная болезнь, диагноз ставят цитогенетическим методом (или молекулярными методами подсчёта хромосом).
• «Тельце Барра есть у всех женщин и отсутствует у всех мужчин». Число телец Барра определяется числом X-хромосом: у мужчины 47,XXY одно тельце, у женщины 45,X — ни одного.
• «ПЦР — это способ прочитать последовательность ДНК». ПЦР размножает заданный участок; чтобы узнать последовательность, нужно секвенирование.
• «В ПЦР используется обычная ДНК-полимераза человека». Используют термостабильную полимеразу бактерий горячих источников, выдерживающую нагрев до 95 °C.
• «При ПЦР праймеры — это нуклеотиды». Праймеры — короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), с которых полимераза начинает синтез.
• «Секвенирование экзома читает весь геном». Экзом — только кодирующие участки (≈ 1–2 % генома).
• «Если в геноме нашли мутацию, человек обязательно заболеет». Многие варианты безвредны или имеют неопределённое значение; даже патогенные могут иметь неполную пенетрантность.
• «Микроматричный анализ находит все хромосомные перестройки». Сбалансированные транслокации и инверсии он не видит.
• «Анализ ДНК для установления отцовства основан на группах крови». Современный анализ основан на STR-маркерах; группы крови позволяли лишь исключить отцовство.
• «FISH и микроматрицы — это цитогенетика, поэтому они не используют знания о ДНК». Оба метода основаны на гибридизации — комплементарном связывании меченых фрагментов ДНК; это методы молекулярной цитогенетики, соединяющие оба подхода.
• «Отрицательный результат секвенирования доказывает, что наследственной болезни нет». Мутация может находиться в участках, которые метод читает плохо, быть структурной или эпигенетической; кроме того, многие гены болезней ещё не открыты.

22. Интересные факты

• Кэри Муллис рассказывал, что идея ПЦР пришла ему в голову весной 1983 г. во время ночной поездки на машине по горной дороге в Калифорнии.
• Бактерию Thermus aquaticus, давшую миру Taq-полимеразу, открыли в 1960-х гг. в горячих источниках Йеллоустонского национального парка — задолго до изобретения ПЦР, просто изучая жизнь в горячей воде. Это пример того, как фундаментальная наука неожиданно даёт практические технологии.
• Первое уголовное дело, раскрытое с помощью ДНК, — расследование двух убийств в графстве Лестершир в Англии в 1986–1987 гг. Анализ ДНК сначала оправдал первого подозреваемого, а затем позволил найти настоящего преступника после массового обследования тысяч мужчин округи.
• Настоящий преступник в этом деле пытался обмануть обследование: он уговорил коллегу сдать кровь под своим именем. Обман раскрылся, когда коллега проговорился об этом в пабе.
• Анализ ДНК применяют и к старинным рукописям: по ДНК пергамента можно установить, из кожи какого животного — телёнка, овцы или козы — он изготовлен, и даже где жили эти животные.
• Скорость секвенирования растёт быстрее, чем производительность компьютеров: стоимость прочтения генома человека снизилась с миллионов долларов в 2007 г. до нескольких сотен долларов в 2020-х гг.
• Синдром Ди Джорджи (делеция 22q11.2) — одна из самых частых микроделеций: примерно 1 случай на 4000 новорождённых. До появления FISH его часто не распознавали, потому что под микроскопом хромосома 22 выглядит нормальной.
• Метод ПЦР настолько чувствителен, что одна случайно попавшая в пробирку клетка исследователя может испортить анализ древней ДНК. Поэтому лаборатории древней ДНК работают в «чистых комнатах», а сотрудники носят защитные костюмы, как в операционной.
• Джанет Роули сделала своё открытие 1973 г., работая неполный рабочий день: она растила четверых детей и анализировала фотографии хромосом за кухонным столом, вырезая хромосомы ножницами и раскладывая их по парам.
• Скрининг новорождённых, предложенный в 1960-х гг. американским врачом Робертом Гатри, стал возможен благодаря простой идее: капля крови высыхает на фильтровальной бумаге и может быть отправлена в лабораторию по почте. Такие «карточки Гатри» используют до сих пор, и из них можно выделить ДНК даже через много лет.
• Первый полностью прочитанный геном конкретного человека методом нового поколения обошёлся примерно в миллион долларов (геном Джеймса Уотсона, 2008 г.); сегодня секвенатор может прочитать десятки геномов в сутки.

23. Частые вопросы

24. ЕГЭ

Методы входят в элемент 3.5 кодификатора [15]: «Методы изучения генетики человека: генеалогический, близнецовый, цитогенетический, популяционно-статистический, молекулярно-генетический. Современное определение генотипа: полногеномное секвенирование, генотипирование, в том числе с помощью ПЦР-анализа». В части 1 встречаются задания на определение метода по описанию, на возможности методов, на число телец Барра. В части 2 — вопросы о том, какие мутации можно выявить каждым методом, как устроена ПЦР, почему праймеры комплементарны концам участка, почему полимераза должна быть термостабильной.

Что обязательно знать к экзамену

• Какие мутации выявляет цитогенетический метод (геномные и хромосомные) и какие — нет (генные).
• Метод определения полового хроматина и число телец Барра.
• Этапы ПЦР и роль компонентов: праймеров, полимеразы, нуклеотидов, матрицы.
• Различие генотипирования и секвенирования.
• Примеры применения молекулярно-генетических методов.

Разбор заданий части 1

Задание. Каким методом можно выявить синдром Клайнфельтера? Ответ: цитогенетическим (кариотип 47,XXY; в клетках буккального эпителия — одно тельце Барра).

Задание. Выберите три верных утверждения о ПЦР: 1) позволяет многократно размножить участок ДНК; 2) использует РНК-полимеразу; 3) включает денатурацию, отжиг праймеров и элонгацию; 4) требует термостабильной ДНК-полимеразы; 5) позволяет увидеть хромосомы в микроскоп; 6) применяется только для диагностики инфекций. Ответ: 134.

Задание. Сколько копий участка ДНК образуется из одной молекулы после 10 циклов ПЦР? Ответ: 2¹⁰ = 1024.

Разбор задания части 2

Задание. Почему при ПЦР смесь нагревают до 95 °C, затем охлаждают до 55 °C, затем нагревают до 72 °C? Почему используют полимеразу бактерии из горячих источников? Ответ. 1) При 95 °C разрываются водородные связи между цепями ДНК — происходит денатурация. 2) При охлаждении праймеры присоединяются к комплементарным участкам цепей (отжиг). 3) При 72 °C полимераза достраивает цепи от праймеров (элонгация) — это оптимальная температура её работы. 4) Полимераза термофильной бактерии не разрушается при многократном нагревании до 95 °C, поэтому её не нужно добавлять в каждом цикле.

25. Для олимпиад

Почему продукт ПЦР имеет строго определённую длину

В первом цикле полимераза строит от праймера цепь «неопределённой» длины — до тех пор, пока не кончится время элонгации. Во втором цикле на этих новых цепях праймер второго направления даёт цепи, которые заканчиваются точно на конце первого праймера. Начиная с третьего цикла появляются двуцепочечные молекулы, ограниченные с обеих сторон праймерами, и их число растёт экспоненциально, а число «длинных» продуктов — лишь линейно. Поэтому после 30 циклов практически весь продукт — фрагмент точно заданной длины.

Эффективность и плато

Реальная эффективность каждого цикла меньше 100 %: число копий умножается не на 2, а на (1 + E), где E — эффективность (обычно 0,9–0,95). После 30 циклов при E = 0,9 получается 1,9³⁰ ≈ 2,3 × 10⁸ копий из одной молекулы — в несколько раз меньше теоретических 10⁹. Кроме того, к концу реакции кончаются праймеры и нуклеотиды, полимераза теряет активность, и накопление выходит на плато. Поэтому для измерения количества ДНК смотрят на цикл, при котором сигнал впервые превысил порог: при эффективности 100 % разница в один цикл означает двукратную разницу исходного количества.

Температура отжига

Температуру отжига выбирают по температуре плавления праймера: чем больше в нём пар Г–Ц (три водородные связи) по сравнению с А–Т (две связи), тем выше эта температура. Простая оценка для коротких праймеров — правило Уоллеса: T_пл ≈ 2 °C × (число А + Т) + 4 °C × (число Г + Ц). Для праймера из 20 нуклеотидов с 10 Г–Ц: 2 × 10 + 4 × 10 = 60 °C. Слишком низкая температура отжига приводит к неспецифическим продуктам, слишком высокая — к отсутствию продукта.

Разрешающая способность и вероятность

Пусть для установления личности используют 20 независимых STR-маркеров, и для каждого вероятность случайного совпадения генотипа у двух неродственных людей равна 0,1. Тогда вероятность совпадения всех 20 маркеров — 0,1²⁰ = 10⁻²⁰, что на много порядков меньше одного на население Земли. Для родственников вероятность совпадения выше, и это учитывают при экспертизе.

Задача на тельца Барра и FISH

В клетках буккального эпителия ребёнка с мужским фенотипом найдено одно тельце Барра, а при FISH интерфазных ядер с зондами к X и Y — две точки X и одна точка Y. Какой кариотип? Ответ: 47,XXY (синдром Клайнфельтера). Если бы точки X было две, а Y не было при мужском фенотипе, следовало бы подумать о кариотипе 46,XX с перемещением гена SRY на X-хромосому — такую ситуацию уточняют FISH с зондом к гену SRY.

26. Задания с разбором

Задание 1

Какие мутации можно выявить цитогенетическим методом?

Задание 2

Сколько телец Барра в клетках людей с кариотипами 46,XY; 47,XXX; 48,XXXY?

Задание 3

Установите соответствие между болезнью и методом её диагностики: А) синдром Дауна; Б) фенилкетонурия (по мутации гена); В) синдром Тёрнера; Г) муковисцидоз (по мутации F508del). 1) цитогенетический; 2) молекулярно-генетический.

Задание 4

Назовите три этапа цикла ПЦР и температуры каждого.

Задание 5

Сколько копий участка ДНК получится из 5 молекул после 20 циклов ПЦР при 100 % эффективности?

Задание 6

Какую функцию выполняют праймеры в ПЦР?

Задание 7

Почему с помощью FISH можно найти микроделецию, которую не видно при обычной окраске хромосом?

Задание 8

Найдите ошибки. 1) Цитогенетическим методом выявляют генные мутации. 2) Для ПЦР нужна термостабильная ДНК-полимераза. 3) Число телец Барра равно числу X-хромосом. 4) Секвенирование позволяет определить последовательность нуклеотидов. 5) Микроматричный анализ выявляет делеции и дупликации.

Задание 9

Чем генотипирование отличается от секвенирования?

Задание 10

У супругов три выкидыша подряд. Какой метод исследования им назначат в первую очередь и почему?

Задание 11

Почему микроматричный анализ не выявляет сбалансированную транслокацию?

Задание 12

Как с помощью ПЦР определить, есть ли в образце РНК-вирус?

Задание 13

У мужчины аллели STR-маркера длиной 12 и 15 повторов, у матери ребёнка — 11 и 14. У ребёнка 11 и 16. Может ли этот мужчина быть отцом?

Задание 14

Почему для анализа ДНК можно использовать слюну, а для кариотипа — нет?

Задание 15

Что такое экзом и почему его секвенирование эффективно для диагностики?

Задание 16

Для чего проверяют генотип по аллелю HLA-B*57:01 перед назначением абакавира?

Задание 17

Почему при пренатальной диагностике по ДНК плода необходимо исключать загрязнение образца клетками матери?

Задание 18

Какими методами можно уточнить диагноз у мальчика с кариотипом 46,XY и подозрением на миодистрофию Дюшенна?

Задание 19 (олимпиадное)

Эффективность ПЦР 90 %. Сколько копий получится из 100 молекул за 25 циклов? Через сколько циклов при эффективности 100 % будет получено то же количество?

Задание 20 (олимпиадное)

Оцените по правилу Уоллеса температуру плавления праймера 5′-AGCTTGCAGGCATCGATTAC-3′.

Литература

1. Pinkel D., Straume T., Gray J. W. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization // PNAS. 1986. Vol. 83, № 9. P. 2934–2938. DOI: 10.1073/pnas.83.9.2934.
2. Miller D. T., Adam M. P., Aradhya S. et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies // American Journal of Human Genetics. 2010. Vol. 86, № 5. P. 749–764. DOI: 10.1016/j.ajhg.2010.04.006.
3. Rowley J. D. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining // Nature. 1973. Vol. 243, № 5405. P. 290–293. DOI: 10.1038/243290a0.
4. Druker B. J., Talpaz M., Resta D. J. et al. Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia // New England Journal of Medicine. 2001. Vol. 344, № 14. P. 1031–1037. DOI: 10.1056/NEJM200104053441401.
5. Southern E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // Journal of Molecular Biology. 1975. Vol. 98, № 3. P. 503–517. DOI: 10.1016/S0022-2836(75)80083-0.
6. Saiki R. K., Scharf S., Faloona F. et al. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985. Vol. 230, № 4732. P. 1350–1354. DOI: 10.1126/science.2999980.
7. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. Vol. 239, № 4839. P. 487–491. DOI: 10.1126/science.2448875.
8. Jeffreys A. J., Wilson V., Thein S. L. Individual-specific ‘fingerprints’ of human DNA // Nature. 1985. Vol. 316, № 6023. P. 76–79. DOI: 10.1038/316076a0.
9. Corman V. M., Landt O., Kaiser M. et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR // Eurosurveillance. 2020. Vol. 25, № 3. Art. 2000045. DOI: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.
10. Clark M. M., Stark Z., Farnaes L. et al. Meta-analysis of the diagnostic and clinical utility of genome and exome sequencing and chromosomal microarray in children with suspected genetic diseases // npj Genomic Medicine. 2018. Vol. 3. Art. 16. DOI: 10.1038/s41525-018-0053-8.
11. Bentley D. R., Balasubramanian S., Swerdlow H. P. et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry // Nature. 2008. Vol. 456, № 7218. P. 53–59. DOI: 10.1038/nature07517.
12. Richards S., Aziz N., Bale S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genetics in Medicine. 2015. Vol. 17, № 5. P. 405–424. DOI: 10.1038/gim.2015.30.
13. Mallal S., Phillips E., Carosi G. et al. HLA-B*5701 screening for hypersensitivity to abacavir // New England Journal of Medicine. 2008. Vol. 358, № 6. P. 568–579. DOI: 10.1056/NEJMoa0706135.
14. Frommer M., McDonald L. E., Millar D. S. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands // PNAS. 1992. Vol. 89, № 5. P. 1827–1831. DOI: 10.1073/pnas.89.5.1827.
15. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.