Установление последовательности пептидов
Концевые остатки и деградация по Эдману
Чтобы прочитать пептид, его «разбирают» с концов по одному остатку или режут на куски ферментами с известной специфичностью.
Как определить концы пептида
- Полный гидролиз — состав: какие аминокислоты и сколько каждой.
- N-конец: реактив Сэнгера (DNFB) или дансилхлорид метят свободную аминогруппу N-конца; после гидролиза меченой оказывается только N-концевая аминокислота (и боковая аминогруппа лизина — ε-DNP-лизин).
- Эдман: PhNCS при pH 9 → фенилтиокарбамоил-пептид; безводная кислота отщепляет N-концевой остаток в виде PTH-производного, остальная цепь цела — цикл повторяют.
- C-конец: карбоксипептидаза отщепляет остатки с C-конца; гидразин (метод Акабори) превращает все остатки, кроме C-концевого, в гидразиды.
Примеры
1. Ala-Gly + PhNCS, затем кислота → PTH-аланин + глицин.
2. Трипептид + DNFB → гидролиз → DNP-Val, Gly, Ser: N-концевой остаток — валин.
errorСэнгер разрушает пептид, Эдман — нет
После метки Сэнгера пептид гидролизуют полностью и узнают только один N-концевой остаток. Эдман отщепляет его, не трогая остальную цепь, поэтому последовательность читают шаг за шагом.
edit_noteПопробуйте сами
Что получится после первого цикла Эдмана из Gly-Leu-Phe?
expand_moreПоказать решение
PTH-глицин и дипептид Leu-Phe.
Ферментативное и химическое расщепление
Длинную цепь Эдман целиком не прочитает. Её режут на фрагменты разными способами и складывают, как мозаику.
Как собрать последовательность из фрагментов
- Трипсин рвёт связь после Lys и Arg (по их COOH), химотрипсин — после Phe, Tyr, Trp; оба не рвут связь перед пролином.
- Бромциан рвёт после метионина (Met превращается в гомосериновый лактон на C-конце фрагмента).
- Получите два набора фрагментов разными методами и найдите перекрывания: фрагменты одного набора «сшивают» границы другого.
- Проверьте: C-конец каждого трипсинового фрагмента (кроме C-концевого) — Lys или Arg; химотрипсинового — Phe, Tyr или Trp.
Примеры
1. Gly-Arg-Phe-Ala-Lys-Ser + трипсин → Gly-Arg, Phe-Ala-Lys, Ser.
2. Тот же пептид + химотрипсин → Gly-Arg-Phe, Ala-Lys-Ser.
errorПролин блокирует трипсин и химотрипсин
Связи Lys-Pro и Phe-Pro не рвутся: пролин сразу после места расщепления мешает ферменту.
edit_noteПопробуйте сами
Какие фрагменты даст бромциан с Ala-Met-Gly-Met-Ser?
expand_moreПоказать решение
Ala-Hse (лактон), Gly-Hse (лактон) и Ser.
push_pinГлавное
Состав: полный гидролиз (6 M HCl, 110 °C, 24 ч), разделение и проявление нингидрином (Trp разрушается, Asn и Gln дают Asp и Glu). N-Конец: реактив Сэнгера (2,4-динитрофторбензол, нуклеофильное ароматическое замещение) или дансилхлорид — метка переживает гидролиз; деградация по Эдману: фенилизотиоцианат присоединяется к N-концу, кислота отщепляет его в виде фенилтиогидантоина (PTH), пептид укорачивается на один остаток — цикл повторяют. C-Конец: карбоксипептидаза или гидразинолиз (Акабори: все остатки, кроме C-концевого, дают гидразиды). Фрагментация: трипсин рвёт после Lys и Arg, химотрипсин — после Phe, Tyr, Trp (оба — не перед Pro), бромциан — после Met. Перекрывающиеся фрагменты двух расщеплений складывают в полную последовательность.
Закрепите теорию: 8 заданий с проверкой и подсказками, урок зачитывается от 70 %.