Установление последовательности пептидов
Концевые остатки и деградация по Эдману
linkОпора
- Урок 378. Пептиды: пептидная связь и синтез — планировать синтез дипептида с защитами
Чтобы прочитать последовательность пептида (урок 378), его либо разбирают с концов по одному остатку, либо разрезают на фрагменты ферментами с известной специфичностью. Начинают всегда с состава и концевых остатков: они задают рамку, в которую потом укладывают фрагменты.
Как определить концы пептида
- Определите состав полным гидролизом (6 M HCl, 110 °C, около суток): он показывает, какие аминокислоты входят в пептид и сколько остатков каждой.
- Найдите N-концевой остаток реактивом Сэнгера (2,4-динитрофторбензол, DNFB) или дансилхлоридом: они метят свободную аминогруппу N-конца. После гидролиза метку несёт только N-концевая аминокислота, а также боковая аминогруппа лизина, если он есть в цепи.
- Проведите деградацию по Эдману: фенилизотиоцианат PhNCS при pH 9 превращает N-концевой остаток в фенилтиокарбамоильное производное, а безводная кислота отщепляет его в виде PTH-аминокислоты. Остальная цепь при этом сохраняется, и цикл можно повторить.
- Определите C-концевой остаток: карбоксипептидаза отщепляет остатки с C-конца по одному, а гидразин (метод Акабори) превращает все остатки, кроме C-концевого, в гидразиды аминокислот.
Примеры
1. Два цикла Эдмана. Тетрапептид Met-Ala-Ser-Gly обрабатывают \(\ce{C6H5NCS}\), а затем безводной кислотой: первый цикл даёт PTH-метионин и трипептид Ala-Ser-Gly, второй — PTH-аланин и дипептид Ser-Gly. Порядок, в котором появляются PTH-производные, и есть последовательность с N-конца.
2. Метка Сэнгера. Пентапептид обработали 2,4-динитрофторбензолом \(\ce{C6H3F(NO2)2}\) и полностью гидролизовали. Среди продуктов оказались DNP-аланин и свободные глицин, фенилаланин, серин и тирозин, значит, N-концевой остаток — аланин; порядок остальных четырёх остатков этот метод не показывает.
errorМетод Сэнгера разрушает пептид, а метод Эдмана — нет
После метки Сэнгера пептид гидролизуют полностью и узнают только один N-концевой остаток. Эдман отщепляет этот остаток, не трогая остальную цепь, поэтому последовательность читают шаг за шагом.
edit_noteПопробуйте сами
Карбоксипептидаза первым отщепила от пептида лейцин. Что это говорит о строении пептида?
expand_moreПоказать решение
Лейцин — C-концевой остаток: карбоксипептидаза отщепляет аминокислоты с C-конца.
Ферментативное и химическое расщепление
Деградация по Эдману надёжно читает лишь несколько десятков остатков подряд. Поэтому длинную цепь сначала разрезают гидролизом амидных связей в определённых местах, читают каждый фрагмент, а затем складывают последовательность из перекрывающихся кусков, как мозаику.
Как собрать последовательность из фрагментов
- Учтите специфичность реагентов: трипсин гидролизует пептидную связь, образованную карбонильной группой Lys или Arg, а химотрипсин — карбонильной группой Phe, Tyr или Trp. Оба фермента не разрывают связь, если следующий остаток — пролин.
- Бромциан \(\ce{BrCN}\) разрывает цепь после метионина; остаток метионина при этом превращается в гомосериновый лактон на C-конце фрагмента.
- Получите два набора фрагментов разными методами и найдите перекрывания: фрагменты одного набора соединяют границы фрагментов другого.
- Проверьте результат: каждый трипсиновый фрагмент, кроме C-концевого, должен заканчиваться остатком Lys или Arg, а каждый химотрипсиновый — остатком Phe, Tyr или Trp.
Примеры
1. Трипсин и химотрипсин. Трипсин разрезает гексапептид Gly-Arg-Phe-Ala-Lys-Ser после остатков Arg и Lys, а химотрипсин — после остатка Phe.
2. Сборка по перекрываниям. Трипсин дал из пентапептида фрагменты Met-Gly и Ser-Phe-Lys, а химотрипсин — фрагменты Ser-Phe и Lys-Met-Gly. Фрагмент Lys-Met-Gly перекрывает границу двух трипсиновых фрагментов и показывает, что после остатка Lys идёт Met; значит, последовательность — Ser-Phe-Lys-Met-Gly. Бромциан \(\ce{BrCN}\) разрезал бы этот пептид после метионина на Ser-Phe-Lys-Hse и Gly — это ещё одна проверка.
errorПролин блокирует трипсин и химотрипсин
Связи Lys–Pro, Arg–Pro и Phe–Pro не гидролизуются: остаток пролина сразу после места расщепления мешает ферменту связать субстрат.
edit_noteПопробуйте сами
Какие фрагменты даст бромциан с Ala-Met-Gly-Met-Ser?
expand_moreПоказать решение
Ala-Hse и Gly-Hse (оба с гомосериновым лактоном на C-конце) и Ser.
push_pinГлавное
Состав: полный гидролиз (6 M HCl, 110 °C, 24 ч), разделение и проявление нингидрином (Trp разрушается, Asn и Gln дают Asp и Glu). N-Конец: реактив Сэнгера (2,4-динитрофторбензол, нуклеофильное ароматическое замещение) или дансилхлорид — метка сохраняется при гидролизе; деградация по Эдману: фенилизотиоцианат присоединяется к N-концу, кислота отщепляет его в виде фенилтиогидантоина (PTH), пептид укорачивается на один остаток — цикл повторяют. C-Конец: карбоксипептидаза или гидразинолиз (Акабори: все остатки, кроме C-концевого, дают гидразиды). Фрагментация: трипсин рвёт после Lys и Arg, химотрипсин — после Phe, Tyr, Trp (оба — не перед Pro), бромциан — после Met. Перекрывающиеся фрагменты двух расщеплений складывают в полную последовательность.
Закрепите теорию: 8 заданий с проверкой и подсказками, урок зачитывается от 70 %.