Генная и хромосомная инженерия

Бактерия, производящая человеческий инсулин; кукуруза, защищённая от гусениц собственным белком; дрожжи, синтезирующие вакцину; пшеница, получившая от дикого злака ген устойчивости к ржавчине вместе с куском его хромосомы. Всё это — результат работы с наследственным материалом: генной и хромосомной инженерии. Разберём, какими инструментами они пользуются, как собирают рекомбинантную ДНК, как ген попадает в клетку и что такое редактирование генома. Это девятая статья серии «Биотехнология».

• 1. О чём речь
• 2. Инструменты генной инженерии
• 3. Как получают нужный ген
• 4. Векторы: как доставить ген в клетку
• 5. Конструирование рекомбинантной ДНК
• 6. Как ДНК попадает в клетку
• 7. Агробактерия — природный генный инженер
• 8. Разбор примера: инсулин человека
• 9. Трансгенные растения
• 10. Трансгенные животные и микроорганизмы
• 11. Редактирование генома
• 12. Хромосомная инженерия
• 13. Достижения и перспективы
• 14. Безопасность и регулирование
• 15. История генной инженерии
• 16. Почему генная инженерия вообще возможна
• 17. Генная терапия
• 18. Синтетическая биология
• 19. Чтение и сборка геномов
• 20. Генная инженерия в нашей стране
• 21. О чём спорят вокруг ГМО
• 22. Тема в числах
• 23. Как читать новости о генной инженерии
• 24. Кто работает в этой области
• 25. Итог: что важно знать
• 26. Словарь темы
• 27. Почему это важно знать
• 28. Частые ошибки
• 29. Интересные факты
• 30. Частые вопросы
• 31. ЕГЭ
• 32. Для олимпиад
• 33. Задания с разбором
• Литература

1. О чём речь

Кодификатор называет: «Хромосомная и генная инженерия. Искусственный синтез гена и конструирование рекомбинантных ДНК. Достижения и перспективы хромосомной и генной инженерии» [1].

Генная инженерия — совокупность методов получения рекомбинантных ДНК и введения их в клетки, где они работают. Её результат — организм с новым или изменённым геном.

Хромосомная инженерия — направленное изменение числа и строения хромосом: перенос отдельных хромосом или их фрагментов от одного вида к другому, удаление или добавление хромосом. Она старше генной и опирается на классическую цитогенетику.

2. Инструменты генной инженерии

Чтобы работать с ДНК, нужно уметь её разрезать в заданных местах, сшивать, размножать, читать и доставлять в клетку. Все эти инструменты — ферменты, заимствованные у микроорганизмов.

Рестриктазы — «ножницы»

Рестриктазы (рестрикционные эндонуклеазы) — бактериальные ферменты, разрезающие двойную спираль ДНК в строго определённых последовательностях, обычно длиной 4–8 пар нуклеотидов. В природе они защищают бактерию от бактериофагов: чужая ДНК разрезается, а собственная защищена метильными метками.

Ключевая особенность многих рестриктаз: они разрезают две цепи со сдвигом, оставляя одноцепочечные выступы — «липкие концы». Например, фермент EcoRI узнаёт последовательность ГААТТЦ и разрезает её между Г и А на обеих цепях. Любые два фрагмента, разрезанные одной рестриктазой, имеют одинаковые липкие концы и потому могут соединиться — даже если один взят у человека, а другой у бактерии. Именно это свойство сделало возможной генную инженерию.

Есть и рестриктазы, разрезающие обе цепи ровно, — они дают «тупые концы», которые сшиваются хуже, но соединяются с любым другим тупым концом.

Лигазы — «клей»

ДНК-лигаза сшивает разрывы в цепи ДНК, восстанавливая связи между нуклеотидами. В клетке она работает при репликации и репарации; в пробирке — соединяет фрагменты, сведённые липкими концами, в единую молекулу.

Полимеразы — «копировальный аппарат»

ДНК-полимераза достраивает цепь ДНК по матрице. На её основе работает полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая размножить выбранный участок ДНК в миллиарды раз [2]. Реакция состоит из повторяющихся циклов: нагрев до 95 °С расплетает ДНК, охлаждение до 50–65 °С позволяет коротким затравкам-праймерам сесть на нужные места, при 72 °С термостабильная полимераза достраивает цепи. За цикл число копий удваивается; за 30 циклов — рост примерно в миллиард раз.

Обратная транскриптаза — фермент вирусов, синтезирующий ДНК по матрице РНК. С её помощью из зрелой мРНК получают кДНК — копию гена без интронов. Это принципиально важно: в бактерии ген эукариота с интронами работать не будет, потому что у бактерий нет аппарата их вырезания.

Прочие инструменты

• Нуклеазы и фосфатазы для подготовки концов фрагментов.
• Электрофорез в геле — разделение фрагментов ДНК по длине: в электрическом поле они движутся к положительному полюсу тем быстрее, чем короче.
• Секвенирование — определение последовательности нуклеотидов.
• Синтезаторы ДНК — приборы, химически собирающие цепочку нуклеотидов заданной последовательности.

3. Как получают нужный ген

Прежде чем ген куда-то встраивать, его нужно иметь в чистом виде. Есть три пути.

1. Вырезать из генома

ДНК организма обрабатывают рестриктазой, получают множество фрагментов и ищут среди них нужный. Способ прямой, но для эукариот неудобен: в вырезанном фрагменте будут интроны, а найти нужный фрагмент среди десятков тысяч других непросто. Исторически для поиска создавали библиотеки генов — наборы бактериальных клонов, каждый из которых несёт свой фрагмент генома, — и отбирали нужный клон с помощью меченого зонда.

2. Синтезировать по мРНК (ферментативный синтез)

Из клеток, активно производящих нужный белок, выделяют мРНК. Например, в клетках поджелудочной железы много мРНК инсулина, в ретикулоцитах — мРНК гемоглобина. Обратная транскриптаза синтезирует по этой мРНК цепь ДНК, затем достраивается вторая цепь — получается кДНК: точная копия кодирующей части гена, уже без интронов. Такой ген будет работать и в бактерии.

3. Синтезировать химически

Искусственный синтез гена — сборка молекулы ДНК из отдельных нуклеотидов в приборе. Последовательность вычисляют по известной последовательности аминокислот белка, пользуясь таблицей генетического кода. Поскольку код вырожден (одну аминокислоту кодируют несколько триплетов), для каждой аминокислоты выбирают тот кодон, который чаще используется в клетке-хозяине, — это повышает выход белка.

Именно так в 1970-х гг. были синтезированы гены соматостатина и цепей инсулина человека [3]. Первый синтез гена вообще выполнил Хар Гобинд Корана с сотрудниками в конце 1960-х — начале 1970-х гг.: это был ген транспортной РНК дрожжей, собранный вручную из коротких фрагментов; работа заняла годы.

Сегодня синтез автоматизирован: заказать фрагмент ДНК длиной в несколько тысяч нуклеотидов — рутинная услуга, а синтезированы уже полные геномы бактерий. Это открывает возможность конструировать гены «с нуля», в том числе таких белков, которых в природе не существует.

4. Векторы: как доставить ген в клетку

Вектор — молекула ДНК, способная самостоятельно размножаться в клетке-хозяине и переносить в неё встроенный фрагмент.

Требования к вектору

• Точка начала репликации — чтобы вектор копировался в клетке.
• Уникальные сайты рестрикции — места, куда можно встроить фрагмент, не разрушив нужные части вектора.
• Маркёр отбора — чаще всего ген устойчивости к антибиотику: клетки, получившие вектор, выживают на среде с антибиотиком, остальные погибают.
• Регуляторные участки — промотор и терминатор, обеспечивающие работу встроенного гена.
• Небольшой размер и удобство выделения.

Основные типы векторов

Плазмида — самый частый вектор. Это небольшая кольцевая ДНК, существующая в бактериальной клетке отдельно от хромосомы и копирующаяся самостоятельно. В природе плазмиды переносят, в частности, гены устойчивости к антибиотикам — и это свойство учёные обратили себе на пользу: именно на нём построен отбор трансформированных клеток. Первые опыты Коэна и Бойера как раз показали, что в плазмиду можно встроить чужеродный фрагмент, и он будет размножаться вместе с ней [4].

5. Конструирование рекомбинантной ДНК

Рекомбинантная ДНК — молекула, собранная из фрагментов разного происхождения. Впервые её получил в 1972 г. Пол Берг с сотрудниками [5].

Схема работы

1. Получают нужный ген одним из трёх описанных способов.
2. Готовят вектор: плазмиду разрезают той же рестриктазой, что и ген, — у них получаются одинаковые липкие концы.
3. Смешивают фрагменты и вектор: липкие концы находят друг друга и соединяются водородными связями.
4. Сшивают лигазой — получается замкнутая кольцевая рекомбинантная плазмида.
5. Вводят в клетки (трансформация).
6. Отбирают клетки, получившие плазмиду, — на среде с антибиотиком.
7. Проверяют, в какие клетки попала именно нужная конструкция: по размеру плазмиды, по ПЦР, по секвенированию.
8. Размножают нужный клон и получают либо много копий гена, либо белок, который он кодирует.

Чтобы ген заработал

Просто встроить ген недостаточно — его нужно снабдить «инструкцией по применению»:

• Промотор — участок, к которому присоединяется РНК-полимераза. Он должен быть «понятен» клетке-хозяину: бактериальный промотор для бактерии, растительный — для растения. Часто используют сильные промоторы, обеспечивающие высокий уровень синтеза, или регулируемые, которые можно включить в нужный момент.
• Участок связывания рибосомы (у бактерий) — без него мРНК не будет транслироваться.
• Терминатор — сигнал окончания транскрипции.
• Сигнальная последовательность, если белок нужно вывести из клетки.
• Оптимизация кодонов под частоту их использования у хозяина.

Конструкция из гена и регуляторных участков называется генетической конструкцией или экспрессионной кассетой. Именно её, а не «голый ген», вводят в клетку.

6. Как ДНК попадает в клетку

После доставки нужно отобрать клетки, где конструкция прижилась. Для этого служат маркёрные гены: устойчивости к антибиотику или гербициду (выживают только трансформированные клетки) и репортёрные гены, продукт которых легко увидеть, — например, ген зелёного флуоресцентного белка GFP, заимствованный у медузы: клетки с ним светятся зелёным в ультрафиолете.

В современных конструкциях маркёры устойчивости стараются затем удалить: в коммерческих сортах их присутствие нежелательно.

7. Агробактерия — природный генный инженер

Отдельного рассказа заслуживает Agrobacterium tumefaciens — почвенная бактерия, вызывающая у растений корончатые галлы (опухоли).

В природе она действует так: проникает в ранку растения, и часть её большой плазмиды — Т-ДНК — переносится в клетку растения и встраивается в её хромосому. В Т-ДНК записаны гены синтеза фитогормонов (клетка начинает бесконтрольно делиться, образуя опухоль) и гены синтеза особых веществ — опинов, которые бактерия использует как питание. По сути, бактерия генетически перепрограммирует растение, заставляя его строить для себя жильё и столовую.

Генные инженеры «обезвредили» этот механизм: из Т-ДНК удалили гены гормонов и опинов, оставив лишь концевые участки, необходимые для переноса, и вставили на их место нужные гены. Получилась идеальная система доставки, работающая за нас: достаточно подержать кусочки ткани растения в суспензии таких бактерий, затем убить бактерии антибиотиком и отобрать трансформированные клетки.

Ограничение — агробактерия плохо заражает однодольные (злаки); для них долго использовали биобаллистику, но сейчас подобраны условия и штаммы, работающие и с рисом, кукурузой, пшеницей.

8. Разбор примера: инсулин человека

Проследим всю цепочку на самом известном примере.

Задача

Инсулин — гормон поджелудочной железы, регулирующий уровень глюкозы в крови. При сахарном диабете первого типа клетки, производящие инсулин, разрушены, и больному нужны ежедневные инъекции гормона. До 1980-х гг. инсулин выделяли из поджелудочных желёз свиней и быков: на годовую потребность одного больного уходили железы десятков животных. Животный инсулин отличается от человеческого одной-тремя аминокислотами и у части больных вызывал аллергию.

Решение

Инсулин состоит из двух цепей — A (21 аминокислота) и B (30 аминокислот), соединённых дисульфидными мостиками. В клетке он образуется из одной длинной цепи — проинсулина, из которой затем вырезается средний участок.

Первый промышленный способ (1978–1982 гг.) был таким:

1. По известной последовательности аминокислот вычислили нуклеотидные последовательности генов цепей A и B и синтезировали их химически [3].
2. Каждый ген встроили в плазмиду рядом с сильным бактериальным промотором и геном бактериального белка — чтобы цепь синтезировалась как часть более крупного белка и не разрушалась ферментами клетки.
3. Плазмиды ввели в кишечную палочку; отобрали клетки с конструкцией.
4. Бактерии вырастили в ферментёрах, клетки разрушили, белки выделили.
5. Химически отщепили «бактериальную» часть, очистили цепи A и B.
6. Соединили цепи, обеспечив образование правильных дисульфидных мостиков, и очистили готовый инсулин.

Позже перешли на более удобный способ: в бактерии синтезируют целый проинсулин, который сам сворачивается правильно, а затем ферментами вырезают средний участок. Используют и дрожжи, которые выделяют предшественник в среду.

Что это дало

• Инсулин стал полностью идентичен человеческому — исчезли аллергические реакции на чужеродный белок.
• Производство перестало зависеть от поголовья скота; препарата хватает на всех больных.
• Появилась возможность создавать аналоги инсулина с изменёнными свойствами: быстро действующие или, наоборот, действующие равномерно сутки. Для этого в гене намеренно меняют отдельные кодоны, и получается белок с заменённой аминокислотой.

Инсулин стал первым лекарством, полученным методами генной инженерии (разрешён в 1982 г.), и образцом для всех последующих.

9. Трансгенные растения

Трансгенный организм — организм, в геном которого введён ген другого вида. Для растений эта технология развита наиболее широко.

Bt-растения: как это работает

Бацилла Bacillus thuringiensis образует белковые кристаллы. Попав в кишечник гусеницы со щелочной средой, кристалл растворяется, белок активируется ферментами и связывается с особыми рецепторами на клетках кишечника, пробивая в них поры. У позвоночных среда желудка кислая, активации не происходит, а нужных рецепторов нет — поэтому белок для них безвреден. Препараты на основе этой бациллы десятилетиями применялись в органическом земледелии; генная инженерия лишь перенесла её ген в само растение.

Выгода: меньше обработок инсектицидами. Риск: отбор устойчивых насекомых. Чтобы его замедлить, рядом с Bt-полем высевают «убежища» — участки обычных растений, где выживают неустойчивые насекомые и разбавляют популяцию устойчивых.

«Золотой рис»

Недостаток витамина A вызывает у детей слепоту и повышает смертность от инфекций; в странах, где основа питания — шлифованный рис, он распространён. В рис ввели два гена (из нарцисса и почвенной бактерии, позже нарцисс заменили кукурузой), дополнившие путь синтеза бета-каротина в эндосперме. Зерно стало жёлто-оранжевым. Проект был некоммерческим; путь до разрешения занял около двадцати лет.

10. Трансгенные животные и микроорганизмы

Микроорганизмы

Это основная «рабочая лошадь» генной инженерии: кишечная палочка и дрожжи производят инсулин, гормон роста, интерфероны, вакцинные белки, ферменты (химозин, фитазу, ферменты для моющих средств), аминокислоты и витамины. Подробно — в статье серии о микробиологическом синтезе.

Животные

• Продуценты лекарств: козы и кролики, выделяющие с молоком лекарственные белки.
• Модели болезней: мыши с введёнными или выключенными генами — основной инструмент изучения функций генов и испытания лекарств.
• Ксенотрансплантация: свиньи с изменённым набором поверхностных молекул.
• Устойчивость к болезням: свиньи, устойчивые к тяжёлой вирусной инфекции, за счёт изменения гена рецептора.
• Хозяйственные признаки: лосось с ускоренным ростом (первое разрешённое к продаже ГМ-животное), безрогий скот.

Отдельное понятие — нокаут гена: целенаправленное выключение определённого гена, чтобы понять его функцию. «Нокаутные» мыши стали основным методом функциональной генетики; за разработку этой технологии присуждена Нобелевская премия 2007 г.

11. Редактирование генома

Классическая генная инженерия встраивает чужой ген в случайное место генома. Редактирование генома позволяет изменить собственный ген организма в точно выбранном месте.

Как это устроено

Нужен инструмент, который найдёт заданную последовательность и внесёт в неё разрыв. Дальше работает сама клетка: двухцепочечный разрыв ДНК опасен, и клетка немедленно его чинит.

• Негомологичное соединение концов — быстрая, но неточная починка: при ней часто теряются или добавляются нуклеотиды. Сдвигается рамка считывания, и ген перестаёт работать. Так выключают гены.
• Гомологичная рекомбинация — точная починка по образцу. Если вместе с инструментом в клетку дать ДНК-матрицу с нужной последовательностью, клетка «починит» разрыв по ней, и в ген будет внесено заданное изменение.

CRISPR-Cas9

Современный инструмент редактирования заимствован у бактерий. У них система CRISPR — своего рода «иммунная память»: фрагменты ДНК ранее атаковавших вирусов хранятся в особом участке генома, с них считываются короткие РНК, и белок Cas9, ведомый такой РНК, находит и разрезает ДНК вируса при новом заражении.

В 2012 г. Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Даудна с сотрудниками показали, что систему можно перенастроить: если дать Cas9 искусственную направляющую РНК, он разрежет ДНК в любом месте, которое этой РНК соответствует [6]. Чтобы нацелить инструмент на новый ген, достаточно синтезировать другую направляющую РНК длиной около двадцати нуклеотидов — это дёшево и быстро. В 2020 г. Шарпантье и Даудна получили Нобелевскую премию по химии.

До CRISPR существовали и другие инструменты точного разрезания — белки с настраиваемыми участками узнавания ДНК, — но их приходилось конструировать заново под каждую мишень, что было долго и дорого.

Что даёт редактирование

• Выключение гена — для изучения его функции, для получения сортов без нежелательного признака (например, картофеля, не темнеющего на срезе).
• Точное исправление мутации — основа генной терапии наследственных болезней.
• Внесение полезного варианта гена без введения чужеродной ДНК: полученное растение генетически неотличимо от растения с такой же природной мутацией. Поэтому в ряде стран такие сорта регулируются мягче, чем трансгенные.
• Множественные изменения — можно нацелить инструмент сразу на несколько генов.

Ограничения

Главная техническая проблема — нецелевые изменения: инструмент может сработать в похожих, но не тех местах генома. Поэтому результат обязательно проверяют секвенированием, а сами инструменты совершенствуют, повышая их избирательность. Кроме того, доставка инструмента в нужные клетки организма остаётся отдельной задачей, особенно в медицине.

Этическая граница проведена чётко: редактирование соматических клеток пациента рассматривается как разновидность лечения и уже применяется, а редактирование половых клеток и зародышей, изменения в которых передавались бы потомкам, запрещено в подавляющем большинстве стран.

12. Хромосомная инженерия

Хромосомная инженерия работает не с отдельными генами, а с хромосомами целиком или их крупными участками. Она старше генной и выросла из классической цитогенетики и отдалённой гибридизации.

Приёмы

• Отдалённая гибридизация с удвоением числа хромосом. Гибрид двух видов обычно бесплоден: хромосомы разных видов не конъюгируют в мейозе. Если удвоить число хромосом (колхицином), каждая хромосома получит гомолога, и растение станет плодовитым. Так создано тритикале — гибрид пшеницы и ржи.
• Замещённые линии. У пшеницы можно заменить пару её хромосом на пару хромосом родственного вида. Сорт получает признаки, записанные в чужой хромосоме, сохраняя остальной геном.
• Дополненные линии. К полному набору хромосом пшеницы добавляется пара чужих — получается форма с дополнительной хромосомой.
• Транслокации. Чаще всего нужен не весь чужой геном и даже не целая хромосома, а один ген устойчивости. Тогда добиваются транслокации — переноса фрагмента чужой хромосомы на хромосому пшеницы. Для этого используют облучение или особые генетические линии, у которых подавлен контроль конъюгации и чужие хромосомы могут обмениваться участками с хромосомами пшеницы.
• Гаплоидия и удвоение. Получение гаплоидов с последующим удвоением — способ за один шаг получить гомозиготную линию.
• Искусственные хромосомы. Сконструированные молекулы с центромерой, теломерами и точками начала репликации, способные существовать в клетке как дополнительная хромосома. Пока это инструмент исследований.

Зачем это нужно

Дикие родичи культурных растений — кладовая устойчивости к болезням, вредителям, холоду и засухе. Но при обычном скрещивании вместе с полезным геном переходит множество нежелательных признаков дикого вида, и «очищать» сорт приходится десятилетиями. Хромосомная инженерия позволяет перенести лишь нужный участок. Классический пример — передача пшенице от ржи фрагмента хромосомы с генами устойчивости к болезням; такая транслокация есть во многих распространённых сортах мира.

Как «видят» хромосомы

Чтобы работать с хромосомами, нужно их различать. Для этого используют:

• дифференциальное окрашивание — каждая хромосома получает характерный рисунок полос;
• гибридизацию с мечеными зондами прямо на препарате хромосом: участок ДНК, помеченный флуоресцентной меткой, связывается со своим местом, и под микроскопом видно, где он находится. Так можно отличить хромосомы ржи в геноме пшеницы — они светятся другим цветом;
• молекулярные маркёры — короткие участки ДНК, характерные для определённой хромосомы или её фрагмента; их выявляют ПЦР.

Сравнение подходов

13. Достижения и перспективы

Медицина

• Лекарственные белки: инсулин, гормон роста, интерфероны, факторы свёртывания крови, эритропоэтин, ферменты для лечения наследственных болезней обмена, моноклональные антитела.
• Вакцины: против гепатита B (белок вируса синтезируют дрожжи), против вируса папилломы человека, векторные и мРНК-вакцины.
• Диагностика: ПЦР-тесты на инфекции и наследственные болезни, определение мутаций в опухолях для подбора лечения.
• Генная терапия: введение рабочей копии гена при наследственных болезнях (например, при некоторых формах наследственной слепоты, спинальной мышечной атрофии, тяжёлом иммунодефиците).
• Клеточная терапия с генной модификацией: CAR-T-лимфоциты против опухолей крови; редактирование стволовых клеток крови при серповидноклеточной анемии и талассемии.

Сельское хозяйство

• Сорта, устойчивые к насекомым, вирусам, гербицидам; сокращение обработок инсектицидами.
• Улучшение питательной ценности («золотой рис», изменённый состав масла).
• Снижение потерь при хранении.
• Ферменты для кормов (фитаза), повышающие усвоение фосфора.
• Устойчивость животных к болезням.

Промышленность и охрана природы

• Ферменты и аминокислоты, получаемые генно-инженерными штаммами.
• Биотопливо и биопластики из возобновляемого сырья.
• Микроорганизмы для очистки сточных вод и разложения загрязнителей.
• Биосенсоры — организмы или белки, подающие сигнал о присутствии вещества.

Наука

Без генной инженерии невозможна современная биология: нокаутные мыши, флуоресцентные метки на белках, выделение любого белка в чистом виде, секвенирование геномов. Методы, созданные для практических задач, вернулись в фундаментальную науку и изменили её.

Перспективы

• Генная терапия в организме — доставка редактирующих инструментов прямо в нужные органы, без извлечения клеток.
• Синтетическая биология — сборка новых путей обмена и даже целых геномов.
• Культуры, устойчивые к засухе и засолению, — ответ на изменение климата.
• Азотфиксация у злаков — давняя мечта: перенести способность усваивать азот воздуха от бобовых и их симбионтов к пшенице и кукурузе; задача исключительно сложная.
• Улучшение фотосинтеза — повышение урожайности за счёт эффективности усвоения углекислого газа.
• Биофабрики — микроорганизмы, производящие лекарства, ароматизаторы, материалы вместо их добычи из природного сырья.

14. Безопасность и регулирование

С самого начала генная инженерия развивалась под строгим контролем — во многом по инициативе самих учёных. В 1975 г. на конференции в Асиломаре исследователи согласовали правила безопасной работы с рекомбинантными ДНК: уровни изоляции, использование ослабленных штаммов, запрет на самые рискованные опыты до выяснения последствий.

Что проверяют у нового ГМ-организма

• Какой ген введён, откуда он, что кодирует, в какое место генома встроен и в скольких копиях.
• Стабильно ли передаётся признак потомству.
• Не изменился ли состав продукта (кроме целевого изменения).
• Не является ли новый белок аллергеном или токсином; как быстро он разрушается при пищеварении.
• Влияние на нецелевые организмы и возможность переноса генов на дикорастущих родичей.
• Многолетние испытания в поле.

Что известно о безопасности

Крупные научные организации, обобщив результаты многолетних исследований, пришли к выводу: разрешённые к обороту ГМ-культуры не опаснее для здоровья, чем их обычные аналоги. Это не означает, что безопасен любой мыслимый ГМО: оценивается каждая конкретная конструкция, а не технология вообще.

Правовые рамки

Международные правила перемещения живых ГМО закреплены Картахенским протоколом по биобезопасности (2000). Национальные законы различаются: где-то ГМ-культуры выращивают на миллионах гектаров, где-то их возделывание запрещено. В России выращивание ГМ-растений и разведение ГМ-животных в сельском хозяйстве запрещено (кроме научных целей), при этом разрешён ввоз проверенной продукции, а генно-инженерные микроорганизмы применяются в промышленности. Продукция, содержащая ГМО выше установленного порога, подлежит маркировке.

15. История генной инженерии

Обратите внимание: от открытия строения ДНК до первой рекомбинантной молекулы прошло менее двадцати лет, а от неё до первого лекарства — десять. Это одна из самых быстро развивавшихся областей биологии.

16. Почему генная инженерия вообще возможна

В основе всей технологии лежат несколько фундаментальных свойств живого — и об этом стоит сказать отдельно, потому что именно такие вопросы любят на экзамене.

• Единство строения ДНК. У всех организмов ДНК построена из одних и тех же четырёх нуклеотидов и имеет одинаковое строение. Поэтому фрагмент ДНК человека химически ничем не отличается от фрагмента ДНК бактерии и может быть с ним сшит.
• Универсальность генетического кода. Один и тот же триплет кодирует одну и ту же аминокислоту почти у всех организмов. Поэтому бактерия, получив ген человека, синтезирует именно человеческий белок.
• Комплементарность. На ней основаны соединение липких концов, работа праймеров в ПЦР, поиск нужных фрагментов меченым зондом, направление инструмента редактирования с помощью РНК.
• Универсальность механизмов транскрипции и трансляции. Хотя регуляторные участки у разных групп организмов различаются, сам принцип считывания одинаков.
• Способность ДНК к репликации — попав в клетку в составе вектора, чужой ген размножается вместе с ней.

Иными словами, генная инженерия возможна потому, что всё живое на Земле родственно и использует одну «молекулярную письменность». Это сильнейший аргумент в пользу единства происхождения жизни — и хороший пример того, как фундаментальное открытие становится основой технологии.

17. Генная терапия

Генная терапия — лечение болезней путём введения в клетки больного генетического материала. Это прямое приложение генной инженерии к человеку.

Два подхода

• Вне организма. У пациента берут клетки (например, стволовые клетки крови или лимфоциты), изменяют их в культуре, проверяют и возвращают в организм. Так лечат наследственные иммунодефициты, талассемию, серповидноклеточную анемию, а также применяют CAR-T-терапию при опухолях крови.
• В организме. Препарат с вектором вводят прямо в ткань или в кровь: в сетчатку глаза при наследственной слепоте, в спинномозговую жидкость или в кровь при спинальной мышечной атрофии, в печень при нарушениях свёртывания.

Чем доставляют

Чаще всего вирусными векторами: аденоассоциированные вирусы (не встраиваются в геном, подходят для долгоживущих клеток — нейронов, клеток сетчатки, печени), лентивирусы (встраиваются, подходят для делящихся клеток крови). Используют и липидные наночастицы — особенно для доставки РНК.

Трудности

• Доставка в нужные клетки и в достаточном количестве.
• Иммунный ответ на вектор: организм может «узнать» вирусную оболочку и уничтожить препарат, а повторное введение становится невозможным.
• Место встраивания. Если вектор встраивается в геном случайно, он может нарушить работу важного гена. В 2000-х гг. у нескольких детей, вылеченных от тяжёлого иммунодефицита, развился лейкоз именно по этой причине; после этого векторы были переработаны.
• Длительность действия. В делящихся клетках невстроенный вектор постепенно теряется.
• Стоимость. Препараты генной терапии — одни из самых дорогих лекарств в мире, поскольку изготавливаются индивидуально или очень малыми сериями.

Что уже работает

Одобрены препараты для лечения наследственной слепоты, спинальной мышечной атрофии, ряда иммунодефицитов, гемофилии, бета-талассемии и серповидноклеточной анемии, а также несколько видов CAR-T-терапии. Это уже не эксперименты, а применяемые методы — хотя и для небольшого числа болезней.

18. Синтетическая биология

Если генная инженерия переносит готовые гены, то синтетическая биология стремится конструировать биологические системы, как инженер конструирует устройство: из стандартных «деталей» — промоторов, генов, регуляторных элементов — собирать схемы с заданным поведением.

• Метаболическая инженерия: в дрожжи перенесли цепочку ферментов из полыни и других организмов, и они стали производить предшественник противомалярийного лекарства артемизинина; подобным образом получают ароматические вещества, витамины, биотопливо.
• Генетические схемы: конструкции, которые включают ген только при определённых условиях — при появлении вещества, при определённой плотности клеток, по сигналу света.
• Биосенсоры: бактерии, светящиеся в присутствии мышьяка в воде или взрывчатых веществ в почве.
• Минимальный геном: созданы бактерии с искусственно собранным геномом, сокращённым до почти минимального набора генов, — инструмент для понимания того, что необходимо живой клетке.
• Расширение генетического алфавита: в лаборатории получены бактерии, использующие дополнительные, не встречающиеся в природе пары оснований и включающие в белки необычные аминокислоты.

Эта область ставит и новые вопросы безопасности: чем сложнее конструкция, тем труднее предсказать её поведение. Поэтому в синтетические организмы часто встраивают «предохранители» — зависимость от вещества, которого нет в природе, так что вне лаборатории клетка не выживет.

19. Чтение и сборка геномов

Генная инженерия немыслима без умения читать ДНК. Этот инструмент развивался параллельно и сегодня определяет её возможности.

Как читают ДНК

• Метод Сэнгера (1977). В реакцию синтеза ДНК добавляют небольшое количество «обрывающих» нуклеотидов, лишённых группы, к которой присоединяется следующий нуклеотид. Синтез случайно останавливается на каждом из них, и получается набор фрагментов разной длины, каждый кончается определённым нуклеотидом. Разделив их по длине и определив, каким нуклеотидом кончается каждый, читают последовательность. Этим методом был прочитан геном человека.
• Секвенирование нового поколения. ДНК разрезают на миллионы коротких кусочков и читают их все одновременно, а затем собирают последовательность по перекрытиям с помощью компьютера. Это резко удешевило чтение: если первый геном человека стоил около трёх миллиардов долларов и занял более десяти лет, то сегодня геном читают за сутки и за сумму порядка сотен долларов.
• Чтение длинных фрагментов. Новые приборы читают десятки тысяч нуклеотидов подряд, в том числе пропуская молекулу ДНК через крошечную пору и измеряя изменения тока. Это позволило «закрыть» трудные участки генома — длинные повторы, которые короткими прочтениями собрать невозможно.

Что это дало

• Знание полных последовательностей геномов человека, сельскохозяйственных животных и растений, продуцентов, возбудителей болезней.
• Возможность находить мутации, вызывающие наследственные болезни, и мутации в опухолях — для подбора лечения.
• Геномную селекцию в животноводстве и растениеводстве.
• Отслеживание эпидемий: по последовательностям геномов вируса видно, как он распространяется и меняется.
• Метагеномику — чтение ДНК целых сообществ микроорганизмов прямо из почвы или воды, без их выращивания.

Знание последовательности — это ещё не понимание. Главная задача современной биологии — выяснить, что делает каждый ген и как гены работают вместе. Именно для этого служат нокауты, редактирование генома и другие приёмы, о которых шла речь.

20. Генная инженерия в нашей стране

Отечественные работы в этой области начались практически одновременно с мировыми. В 1970-е гг. в институтах Академии наук и в отраслевых институтах развернулись исследования по рекомбинантным ДНК; в 1980-е был получен отечественный генно-инженерный инсулин и интерферон, созданы штаммы-продуценты ферментов и аминокислот.

Сегодня в России:

• производятся генно-инженерные инсулины, гормон роста, интерфероны, моноклональные антитела, вакцины;
• работают предприятия, выпускающие ферменты и аминокислоты на основе генно-инженерных штаммов;
• ведутся исследования по редактированию генома растений и животных, по генной терапии;
• действует запрет на выращивание ГМ-растений и разведение ГМ-животных в сельском хозяйстве (кроме научных целей), при этом разрешены ввоз и использование прошедшей проверку продукции;
• созданы центры геномных исследований, читающие геномы сельскохозяйственных культур, пород скота и микроорганизмов.

Отдельная задача, о которой много говорят, — развитие собственного производства ферментов, компонентов сред и реактивов для биотехнологии: без них невозможна независимая работа ни в медицине, ни в сельском хозяйстве.

21. О чём спорят вокруг ГМО

Тема ГМО вызывает в обществе больше споров, чем почти любая другая биологическая тема. Разберём основные доводы — так, как они выглядят с научной точки зрения.

С другой стороны, у технологии есть и реальные ограничения: она не решает проблему голода сама по себе (причины голода чаще экономические и политические), не отменяет необходимости севооборота и агротехники, и каждая новая конструкция требует дорогой и долгой проверки.

Разумная позиция, которой придерживаются научные организации, такова: оценивать нужно не «технологию вообще», а конкретный организм и конкретный признак — так же, как мы оцениваем новый сорт или новый препарат.

22. Тема в числах

Эти величины помогают оценивать правдоподобие утверждений и часто нужны в расчётных заданиях.

23. Как читать новости о генной инженерии

Сообщения об очередном прорыве появляются едва ли не еженедельно. Несколько вопросов помогают оценить их по существу.

1. На ком сделана работа? На клетках в чашке, на мышах, на людях? Результат, полученный на клеточной культуре, отделён от применения у человека годами испытаний.
2. Сколько было объектов? Опыт на трёх животных и клиническое исследование на тысяче пациентов — разные уровни доказательности.
3. Что именно изменили? Ввели чужой ген, выключили собственный, исправили мутацию? От этого зависит и суть, и регулирование.
4. Соматические клетки или половые? Изменения в соматических клетках не передаются потомству, в половых — передаются; второе почти везде запрещено.
5. Есть ли сравнение с существующими методами? Новый подход должен быть лучше имеющихся, а не просто «новым».
6. Где опубликовано? Рецензируемый научный журнал — не гарантия истины, но минимальный фильтр; пресс-релиз компании им не является.
7. Что говорят независимые специалисты? В хороших материалах всегда приводится мнение учёных, не участвовавших в работе.

Эти же вопросы полезны и при чтении пугающих сообщений: нередко оказывается, что речь идёт о единичном опыте, о другом организме или о выводе, которого авторы работы не делали.

24. Кто работает в этой области

Генная инженерия давно перестала быть делом одиночек: над одним препаратом работают десятки специалистов разных профессий.

• Молекулярный биолог конструирует генетическую конструкцию: подбирает промотор, оптимизирует кодоны, проверяет последовательность.
• Клеточный биолог создаёт и ведёт линию-продуцент, подбирает среду и режим выращивания.
• Биотехнолог-технолог переносит процесс из колбы в биореактор, отвечает за масштабирование и выход.
• Специалист по очистке разрабатывает стадии выделения: хроматографию, фильтрацию, удаление вирусов.
• Аналитик проверяет структуру белка, его активность, чистоту, стабильность — десятки показателей на каждую партию.
• Биоинформатик анализирует геномы, предсказывает структуру белков, ищет нецелевые изменения при редактировании.
• Специалист по регистрации готовит документы для разрешительных органов: доказательства безопасности и эффективности.
• Инженеры и метрологи обслуживают оборудование и системы чистых помещений.

Образование для этих специальностей дают биологические, биотехнологические, химические и медицинские факультеты. Общее требование одно: кроме знания биологии, нужны химия, математика и умение работать с данными — современная биотехнология держится на точных измерениях и расчётах не меньше, чем на умении обращаться с живыми культурами.

25. Итог: что важно знать

• Генная инженерия — получение рекомбинантных ДНК и введение их в клетки; хромосомная инженерия — перенос целых хромосом и их участков.
• Рестриктазы режут ДНК в определённых последовательностях, оставляя липкие концы; лигаза сшивает фрагменты; обратная транскриптаза синтезирует ДНК по РНК; ПЦР размножает выбранный участок.
• Ген получают тремя способами: вырезанием из генома, синтезом по мРНК (кДНК без интронов), химическим синтезом по известной последовательности белка.
• Вектор (чаще плазмида) должен иметь точку начала репликации, сайты рестрикции, маркёр отбора и регуляторные участки.
• Рекомбинантная ДНК: ген и вектор режут одной рестриктазой, соединяют липкими концами и сшивают лигазой; затем вводят в клетку и отбирают трансформированные клетки по маркёру.
• Способы доставки: химическая трансформация и электропорация (бактерии), агробактерия и биобаллистика (растения), микроинъекция и вирусные векторы (животные).
• Для работы гена нужны промотор, участок связывания рибосомы, терминатор, понятные клетке-хозяину.
• Инсулин — первый генно-инженерный препарат (1982); гены цепей были синтезированы химически.
• Редактирование генома (CRISPR-Cas9) вносит разрыв в заданном месте, а клетка чинит его — с ошибкой (выключение гена) или по матрице (точное изменение).
• Редактирование соматических клеток разрешено и применяется; изменение генома зародышей человека запрещено.
• Хромосомная инженерия даёт замещённые и дополненные линии, транслокации устойчивости, тритикале.

26. Словарь темы

• Генная инженерия — методы получения рекомбинантных ДНК и введения их в клетки.
• Рекомбинантная ДНК — молекула, собранная из фрагментов разного происхождения.
• Рестриктаза — фермент, разрезающий ДНК в определённой последовательности; липкие концы — одноцепочечные выступы на месте разреза.
• Лигаза — фермент, сшивающий фрагменты ДНК.
• Обратная транскриптаза — фермент, синтезирующий ДНК на матрице РНК; кДНК — полученная так копия гена без интронов.
• ПЦР — полимеразная цепная реакция, размножение участка ДНК в пробирке; праймер — короткая затравка.
• Вектор — молекула-переносчик, размножающаяся в клетке; плазмида — кольцевая ДНК бактерий.
• Трансформация — введение ДНК в клетку; трансгенный организм — организм с введённым геном другого вида.
• Промотор, терминатор — регуляторные участки, обеспечивающие начало и конец транскрипции.
• Маркёрный ген — ген, позволяющий отобрать трансформированные клетки.
• Т-ДНК — участок плазмиды агробактерии, переносимый в геном растения.
• Редактирование генома — внесение изменения в заданное место собственного генома; CRISPR-Cas9 — заимствованная у бактерий система для этого.
• Нокаут гена — целенаправленное выключение гена.
• Хромосомная инженерия — перенос хромосом и их участков; замещённая и дополненная линии, транслокация.
• ГМО — организм, геном которого изменён методами генной инженерии.

27. Почему это важно знать

• Генная инженерия — область, о которой чаще всего спорят в обществе; понимание механизмов позволяет судить о ней по существу, а не по слухам.
• Её продукты человек встречает постоянно: инсулин и вакцины, сыр со «сконструированным» химозином, ферменты в порошках, ПЦР-тест в поликлинике.
• Тема связывает молекулярную биологию (ДНК, код, транскрипция, трансляция) с практикой и показывает, как фундаментальные открытия превращаются в технологии.
• Вопросы на экзамене нередко требуют именно объяснения механизма: почему нужна кДНК, зачем маркёрный ген, почему универсальность кода делает возможным перенос генов.
• Наконец, это область, где особенно важна способность отделять установленное от спорного и научную оценку риска — от бытовых страхов.

28. Частые ошибки

• «Рестриктазы разрезают ДНК в случайных местах». Каждая рестриктаза узнаёт свою определённую последовательность и режет только её.
• «Липкие концы — это клей». Это короткие одноцепочечные участки; они соединяются водородными связями по принципу комплементарности, а сшивает цепи лигаза.
• «Ген человека можно просто вставить в бактерию, и он заработает». Нужны кДНК без интронов и регуляторные участки, понятные бактерии: бактериальный промотор, участок связывания рибосомы.
• «Вектор — это инструмент для разрезания». Вектор — молекула-переносчик, способная размножаться в клетке.
• «Плазмида — это вирус». Плазмида — кольцевая ДНК бактерии, не имеющая белковой оболочки и не покидающая клетку самостоятельно (кроме конъюгации).
• «Агробактерия — лабораторное изобретение». Это природная почвенная бактерия, которая сама переносит свою ДНК в растения; человек лишь обезвредил и приспособил её.
• «Редактирование генома и трансгенез — одно и то же». При трансгенезе вводят чужой ген, при редактировании изменяют собственный, и чужеродной ДНК в результате может не остаться.
• «CRISPR — это фермент». CRISPR — участок генома бактерий (система иммунной памяти); разрезает ДНК белок Cas9, направляемый РНК.
• «Белок Bt ядовит для человека». Для активации ему нужны щелочная среда кишечника насекомого и особые рецепторы; у позвоночных ни того, ни другого нет.
• «ГМО — это любой организм, изменённый человеком». ГМО — организм, геном которого изменён методами генной инженерии; сорта, полученные мутагенезом или гибридизацией, к ГМО не относят.
• «Хромосомная инженерия — это генная инженерия». Это разные подходы: в первом переносят хромосомы и их участки, во втором — отдельные гены.

29. Интересные факты

• Рестриктазу EcoRI, с которой начиналась генная инженерия, выделили из кишечной палочки; её название расшифровывается как первая рестриктаза штамма R из Escherichia coli.
• Ген зелёного флуоресцентного белка, позволяющий видеть работу генов в живой клетке, заимствован у медузы; за работы с ним присуждена Нобелевская премия по химии 2008 г.
• Идея ПЦР пришла Кэри Маллису, по его рассказу, во время ночной поездки по горной дороге в Калифорнии; сегодня эта реакция — основа диагностики инфекций и криминалистики.
• Первый трансгенный организм, попавший на рынок как пищевой продукт, — томат с замедленным размягчением плодов (1994). Коммерчески он оказался неудачным и был снят с продажи.
• Папайю на Гавайях спасла от вирусной болезни именно генная инженерия: трансгенный сорт с геном белка оболочки вируса сохранил отрасль.
• Бактериальная система CRISPR была описана задолго до того, как поняли её назначение: странные повторы в геноме бактерий заметили ещё в 1987 г., а их роль как «иммунной памяти» выяснили лишь в 2000-х.
• Химозин для сыроделия стал одним из первых ферментов, который начали получать с помощью генно-инженерных микроорганизмов; сегодня им свёртывают молоко для большой части мирового производства сыра.
• Синтез первого гена, выполненный группой Кораны, занял несколько лет ручной работы; сегодня такой фрагмент синтезирует прибор за несколько часов.
• Белок Cas9, которым режут ДНК в лаборатории, взят у бактерии стрептококка — возбудителя ангины; её «иммунная система» против вирусов оказалась удобнейшим инструментом.
• В генной инженерии широко используют «молчащие» замены: меняют кодон, не меняя аминокислоту. Так в ген вносят метки, по которым потом отличают его от природного.

30. Частые вопросы

Почему для встраивания гена и вектор, и ген режут одной рестриктазой?

Чтобы у них образовались одинаковые липкие концы — комплементарные одноцепочечные участки. Тогда фрагменты соединятся друг с другом по принципу комплементарности, а лигаза сошьёт разрывы.

Зачем нужен ген устойчивости к антибиотику в плазмиде?

Как маркёр отбора. Плазмида попадает далеко не в каждую клетку; если высеять культуру на среду с антибиотиком, выживут только клетки, получившие плазмиду с геном устойчивости.

Почему ген эукариота не работает в бактерии, если его вырезать из генома?

Гены эукариот содержат интроны, которые вырезаются из первичного РНК-транскрипта специальным аппаратом сплайсинга. У бактерий такого аппарата нет: они прочитают весь транскрипт целиком, и белок получится неправильным. Поэтому используют кДНК, полученную по зрелой мРНК.

Чем кДНК отличается от гена?

кДНК — копия зрелой мРНК, то есть только кодирующая часть гена, без интронов и без регуляторных участков. Ген в геноме содержит и интроны, и промотор, и другие регуляторные последовательности.

Можно ли считать трансгенный организм новым видом?

Нет. Введение одного-двух генов не меняет видовую принадлежность: трансгенная кукуруза остаётся кукурузой. Вид определяется совокупностью признаков, общностью происхождения и репродуктивной изоляцией.

Опасны ли продукты из ГМ-растений?

Разрешённые к обороту ГМ-культуры прошли проверку на аллергенность, токсичность и состав; крупные научные организации не нашли доказательств их большей опасности по сравнению с обычными сортами. При этом каждую новую конструкцию проверяют отдельно: безопасность оценивается не у «технологии вообще», а у конкретного организма.

Почему ДНК из съеденного растения не встраивается в наши гены?

Любая ДНК пищи — и обычной, и генно-модифицированной — расщепляется в пищеварительном тракте до нуклеотидов. Механизма встраивания пищевой ДНК в геном клеток человека не существует. Съедая помидор, мы не приобретаем его генов.

Чем генная терапия отличается от редактирования генома?

Классическая генная терапия добавляет в клетки рабочую копию гена, не исправляя повреждённую. Редактирование изменяет собственный ген пациента в нужном месте. Оба подхода применяют к соматическим клеткам; изменения не передаются потомству.

Что такое «нокаут гена» и зачем он нужен?

Целенаправленное выключение гена, чтобы понять, за что он отвечает: смотрят, что нарушится у организма без этого гена. Это основной метод выяснения функций генов.

31. ЕГЭ

Тема относится к элементу 3.7 кодификатора [1]: «Хромосомная и генная инженерия. Искусственный синтез гена и конструирование рекомбинантных ДНК. Достижения и перспективы хромосомной и генной инженерии». Она опирается на знание строения ДНК, генетического кода, транскрипции и трансляции, строения прокариотической клетки.

Что обязательно знать

• Определения: генная инженерия, хромосомная инженерия, рекомбинантная ДНК, вектор, плазмида, трансгенный организм, ГМО.
• Ферменты: рестриктазы (режут), лигаза (сшивает), обратная транскриптаза (ДНК по РНК), ДНК-полимераза (ПЦР).
• Три способа получения гена и почему для бактерий нужна кДНК.
• Последовательность этапов получения трансгенного организма.
• Примеры достижений: инсулин, вакцина против гепатита B, Bt-растения, «золотой рис», химозин.
• Что такое редактирование генома и чем оно отличается от трансгенеза.
• Примеры хромосомной инженерии: тритикале, замещённые линии.

Разбор типичных формулировок

«Установите последовательность этапов получения бактерии-продуцента белка человека». 1) Выделение или синтез гена; 2) разрезание плазмиды и гена одной рестриктазой; 3) сшивание лигазой — получение рекомбинантной плазмиды; 4) введение плазмиды в бактерию; 5) отбор клеток с плазмидой; 6) выращивание культуры и получение белка.

«Установите соответствие между ферментом и его функцией». Рестриктаза — разрезает ДНК в определённой последовательности; лигаза — сшивает фрагменты; обратная транскриптаза — синтезирует ДНК на матрице РНК; ДНК-полимераза — достраивает цепь по матрице ДНК; РНК-полимераза — синтезирует РНК на матрице ДНК.

«Выберите три верных утверждения о генной инженерии». Верные: используются ферменты бактерий; вектором часто служит плазмида; ген, встроенный в бактерию, может кодировать белок человека; для отбора применяют гены устойчивости к антибиотикам. Ловушки: «новый организм относится к новому виду», «ДНК пищи встраивается в геном человека», «рестриктазы разрезают ДНК в случайных местах».

Часть 2: «Почему для получения инсулина в бактериях используют не ген из генома человека, а ДНК, синтезированную по мРНК?» Элементы ответа: 1) гены человека содержат интроны; 2) бактерии не способны вырезать интроны из транскрипта; 3) кДНК, синтезированная обратной транскриптазой по зрелой мРНК, содержит только кодирующие участки; 4) поэтому в бактерии получается правильный белок.

Часть 2: «Какие преимущества имеет получение инсулина генно-инженерным способом?» Элементы: 1) белок полностью идентичен человеческому, не вызывает аллергии; 2) производство не зависит от поголовья скота, можно получать в любых количествах; 3) продукт более чистый и дешёвый; 4) возможно создание аналогов с заданными свойствами.

32. Для олимпиад

ПЦР: расчёт числа копий

За каждый цикл число копий участка удваивается: N = N₀ · 2ⁿ. За 30 циклов из одной молекулы теоретически получается 2³⁰ ≈ 1,07 · 10⁹ копий. На практике эффективность ниже 100 %, и рост описывается как (1 + E)ⁿ, где E — эффективность. При E = 0,9 за 30 циклов: 1,9³⁰ ≈ 2,3 · 10⁸ — в несколько раз меньше теоретического.

На этом основан количественный ПЦР: чем больше исходных копий, тем раньше сигнал достигает порога. Разница в один цикл означает двукратную разницу в исходном количестве ДНК.

Сколько сайтов рестрикции в геноме

Рестриктаза узнаёт последовательность из 6 нуклеотидов. Если считать нуклеотиды равновероятными и независимыми, вероятность встретить заданную шестёрку в данной точке равна (1/4)⁶ = 1/4096. В геноме кишечной палочки (4,6 · 10⁶ пар нуклеотидов) ожидается около 4,6 · 10⁶ / 4096 ≈ 1100 сайтов. Для рестриктазы с сайтом из 4 нуклеотидов: 1/256, то есть около 18 000 сайтов — фрагменты получатся гораздо короче. Отсюда правило: для работы с крупными фрагментами берут рестриктазы с длинным сайтом узнавания.

Вырожденность кода и обратная задача

При химическом синтезе гена по последовательности белка возникает трудность: большинство аминокислот кодируются несколькими триплетами. Например, лейцин — шестью, аргинин — шестью, серин — шестью, а метионин и триптофан — одним. Если в белке 50 аминокислот, число возможных нуклеотидных последовательностей, кодирующих его, огромно. Выбирают те кодоны, которые чаще всего используются в клетке-хозяине: в клетке больше соответствующих транспортных РНК, и трансляция идёт быстрее. Это называют оптимизацией кодонов.

Задача на понимание

Почему ген, встроенный в плазмиду «задом наперёд», не будет работать, хотя сама последовательность не изменилась? Ответ: транскрипция идёт в одном направлении от промотора. Если ген встроен в обратной ориентации, РНК-полимераза будет считывать не ту цепь, и получится бессмысленная РНК. Поэтому при конструировании следят за ориентацией вставки, используя рестриктазы с разными сайтами на концах фрагмента.

Ещё одна задача

Фрагмент ДНК длиной 3000 пар нуклеотидов обработали двумя рестриктазами. Первая дала фрагменты 1200 и 1800; вторая — 700 и 2300; обе вместе — 700, 500 и 1800. Где находятся сайты? Решение: первая режет на расстоянии 1200 от одного конца, вторая — 700 от того же конца (так как совместная обработка даёт 700 и 500, то есть 700 + 500 = 1200). Значит, сайты расположены в точках 700 и 1200, а оставшийся участок — 1800.

33. Задания с разбором

Задание 1

Что такое генная инженерия и чем она отличается от хромосомной?

Задание 2

Установите соответствие между ферментом и его ролью: А) рестриктаза; Б) лигаза; В) обратная транскриптаза; Г) ДНК-полимераза. Роли: 1) сшивает фрагменты ДНК; 2) разрезает ДНК в определённых последовательностях; 3) достраивает цепь ДНК по матрице ДНК; 4) синтезирует ДНК на матрице РНК.

Задание 3

Что такое липкие концы и почему они важны?

Задание 4

Перечислите этапы получения бактерии, производящей белок человека.

Задание 5

Почему для работы в бактериях используют кДНК, а не ген из генома человека?

Задание 6

Какие требования предъявляют к вектору? Назовите не менее трёх.

Задание 7

Зачем нужен промотор и почему он должен соответствовать клетке-хозяину?

Задание 8

Найдите ошибки и исправьте: 1) Рестриктазы разрезают ДНК в случайных местах. 2) Плазмида — кольцевая молекула ДНК бактерий. 3) Лигаза сшивает фрагменты ДНК. 4) Трансгенный организм относится к новому виду. 5) Агробактерию используют для переноса генов в растения.

Задание 9

Как с помощью агробактерии получают трансгенное растение?

Задание 10

Что такое ПЦР и для чего её применяют?

Задание 11

Приведите не менее четырёх достижений генной инженерии в медицине.

Задание 12

Что такое редактирование генома и чем оно отличается от введения чужого гена?

Задание 13

Как устроена защита Bt-растений от насекомых и почему белок безопасен для человека?

Задание 14

Приведите примеры хромосомной инженерии.

Задание 15

Зачем в генетическую конструкцию включают маркёрные гены?

Задание 16

Почему ДНК из пищи не встраивается в геном человека?

Задание 17

Какие свойства ДНК делают возможной генную инженерию? Назовите не менее трёх.

Задание 18

Что проверяют перед допуском нового ГМ-сорта? Назовите не менее четырёх пунктов.

Задание 19 (олимпиадное)

Линейный фрагмент ДНК длиной 5000 пар нуклеотидов обработали рестриктазой A — получили 2000 и 3000; рестриктазой B — 1500 и 3500; обеими вместе — 1500, 500 и 3000. Постройте карту: где расположены сайты? Сколько сайтов узнавания из шести нуклеотидов ожидается в геноме длиной 3 · 10⁹ пар?

Задание 20 (олимпиадное)

В ПЦР за 25 циклов из одной молекулы получилось около 3 · 10⁶ копий вместо теоретических 3,4 · 10⁷. Какова средняя эффективность реакции за цикл? Почему эффективность бывает ниже единицы и почему на поздних циклах рост замедляется?

Литература

1. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.
2. Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. Vol. 239, № 4839. P. 487–491. DOI: 10.1126/science.2448875.
3. Goeddel D. V., Kleid D. G., Bolivar F. et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1979. Vol. 76, № 1. P. 106–110. DOI: 10.1073/pnas.76.1.106.
4. Cohen S. N., Chang A. C. Y., Boyer H. W., Helling R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1973. Vol. 70, № 11. P. 3240–3244. DOI: 10.1073/pnas.70.11.3240.
5. Jackson D. A., Symons R. H., Berg P. Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1972. Vol. 69, № 10. P. 2904–2909. DOI: 10.1073/pnas.69.10.2904.
6. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. Vol. 337, № 6096. P. 816–821. DOI: 10.1126/science.1225829.