Микробиологический синтез: белок, аминокислоты, витамины

Лизин в корме для свиней и кур, глутамат натрия в приправах, витамин B₁₂ в аптеке, лимонная кислота в газировке, пенициллин, ферменты в стиральном порошке — всё это производят микроорганизмы в огромных ферментёрах. Такое производство называют микробиологическим синтезом. Как заставить бактерию выделять в среду вещество, которое ей самой нужно в микроскопических количествах? Какие микроорганизмы что производят? Почему кормовой белок выгоднее выращивать в ферментёре, чем на поле? Это четвёртая статья серии «Биотехнология».

• 1. Что такое микробиологический синтез
• 2. Объекты микробиологических технологий
• 3. Как заставить клетку производить больше, чем ей нужно
• 4. Производство белка
• 5. Производство аминокислот
• 6. Производство витаминов
• 7. Органические кислоты и спирты
• 8. Антибиотики
• 9. Ферменты
• 10. Полисахариды и биополимеры
• 11. Рекомбинантные белки
• 12. Микробиологический и химический синтез: сравнение
• 13. Биотрансформация: микробы на службе химиков
• 14. Технологическая схема микробиологического синтеза
• 15. Как развивался микробиологический синтез
• 16. Откуда берутся штаммы-продуценты
• 17. Экономика процесса: из чего складывается цена
• 18. Микробиологический синтез и охрана природы
• 19. Пенициллин: как рождалась отрасль
• 20. Разбор примера: производство лизина
• 21. Как подбирают промышленный фермент
• 22. Словарь темы
• 23. Витамины: кто и как их получает
• 24. Закваски, пробиотики и биопрепараты
• 25. Генно-инженерные продуценты: что это меняет
• 26. Куда движется микробиологический синтез
• 27. Итог: что важно знать
• 28. Частые ошибки
• 29. Почему это важно знать
• 30. Интересные факты
• 31. Частые вопросы
• 32. ЕГЭ
• 33. Для олимпиад
• 34. Задания с разбором
• Литература

1. Что такое микробиологический синтез

Микробиологический синтез — промышленное получение веществ с помощью микроорганизмов: микроорганизм-продуцент, выращиваемый в контролируемых условиях, образует из относительно простых и дешёвых веществ среды сложное ценное соединение. Кодификатор называет «микробиологический синтез», «объекты микробиологических технологий» и «производство белка, аминокислот и витаминов» [1].

Важно отличать три типа процессов:

• Получение биомассы — нужны сами клетки: кормовые и пекарские дрожжи, белок микроорганизмов, закваски, бактериальные удобрения, пробиотики.
• Получение продуктов обмена (метаболитов) — клетки выделяют вещество в среду или накапливают его: аминокислоты, витамины, органические кислоты, антибиотики, ферменты, полисахариды.
• Биотрансформация — клетки или ферменты превращают готовое вещество, добавленное в среду, в другое, проводя одну-две реакции, трудных для химиков: например, превращение сорбита в сорбозу при синтезе витамина C или модификация стероидов при получении гормональных лекарств.

Почему не химический синтез

Многие продукты микробиологического синтеза можно получить и химически, но микробы выигрывают по нескольким причинам.

• Сложность молекул. Витамин B₁₂ содержит более 180 атомов и ион кобальта; его химический синтез занял у группы Р. Вудворда и А. Эшенмозера около 12 лет и включает десятки стадий — промышленного значения он не имеет. Бактерии строят его сами.
• Нужная зеркальная форма. Аминокислоты белков существуют в двух зеркальных формах (L и D), а организм использует только L-формы. Химический синтез даёт смесь обеих форм, а бактерия синтезирует только L-форму.
• Мягкие условия и возобновляемое сырьё: сахар, крахмал, меласса вместо нефтехимии, высоких температур и давления.
• Масштабируемость: один штамм в одном ферментёре на сотни кубометров даёт тонны продукта в сутки.

Химия выигрывает, когда молекула проста и сырьё дёшево: метионин для кормов, например, в основном синтезируют химически, потому что животное усваивает и смесь форм этой аминокислоты.

2. Объекты микробиологических технологий

Объектами микробиологического синтеза служат бактерии и грибы, а в последние десятилетия — и генно-инженерные штаммы, получившие чужие гены.

Подробно о группах микроорганизмов и их свойствах рассказано во второй статье серии.

3. Как заставить клетку производить больше, чем ей нужно

Живая клетка экономна. Она синтезирует аминокислоту или витамин ровно в том количестве, которое нужно для роста, и не выделяет их в среду. Это обеспечивают механизмы регуляции, сложившиеся в ходе эволюции: перерасход ресурсов снижает приспособленность, и такие клетки проигрывают конкуренцию. Чтобы получить промышленного продуцента, эту экономию нужно сломать.

Механизмы, которые мешают перепроизводству

• Ингибирование по принципу обратной связи. Конечный продукт пути (например, аминокислота) присоединяется к первому ферменту пути и подавляет его активность. Как только аминокислоты достаточно, её синтез останавливается за секунды.
• Репрессия генов. Избыток конечного продукта выключает транскрипцию генов ферментов пути (как в триптофановом опероне кишечной палочки). Это более медленная, но экономная регуляция: клетка не тратит ресурсы на синтез ненужных ферментов.
• Распределение сырья между путями. Предшественник может идти на разные продукты; клетка направляет его туда, где он нужнее.
• Отсутствие выброса. Нужное клетке вещество удерживается внутри; переносчики, выводящие его из клетки, работают слабо.

Как получают продуцентов

Продуцентов получают селекцией: отбирают штаммы, у которых нормальная регуляция пути ослаблена и продукт выделяется в среду, а затем улучшают их методами генетики и генной инженерии с опорой на прочитанный геном [2]. Первые продуценты глутаминовой кислоты открыл С. Киносита [3].

Что даёт знание генома продуцента

Когда в 2003 г. была прочитана полная последовательность генома коринебактерии [2], стало возможно сравнивать геномы промышленных штаммов с исходным природным и видеть, какие именно изменения накопились за десятилетия селекции. Оказалось, что у «рекордсменов» изменены не один-два гена, а десятки: ферменты путей синтеза, переносчики, гены центрального обмена, регуляторы. Многие из этих изменений селекционеры получили вслепую, не зная, что именно они меняют.

Это дало новый приём: полезные изменения можно переносить в «чистый» природный штамм по одному, собирая продуцента заново — без груза случайных мутаций, снижающих жизнеспособность. Такой штамм растёт быстрее, стабильнее и лучше переносит промышленные условия.

Обратная сторона: нестабильность

Поскольку перепроизводство невыгодно самой клетке, в культуре продуцента всегда есть давление отбора в пользу ревертантов — клеток, вернувших нормальную регуляцию. Они растут быстрее и постепенно вытесняют продуктивные клетки. Поэтому производственный цикл начинают с проверенной коллекционной культуры, а длительность непрерывных процессов ограничивают.

4. Производство белка

Зачем нужен микробный белок

Животноводству постоянно не хватает белка. Зерно, основа кормов, богато крахмалом, но бедно белком, и в его белке мало незаменимых аминокислот — прежде всего лизина. Традиционно корма дополняют соевым шротом, рыбной и мясокостной мукой, но их производство ограничено площадями и уловами. Микроорганизмы предлагают другой путь: белок, выращенный в ферментёре.

Белок, полученный из биомассы микроорганизмов, называют белком одноклеточных (в английской литературе — single cell protein) или кормовым белком [4]. Его преимущества:

• Высокое содержание белка: у бактерий — до 60–80 % сухой массы, у дрожжей — 40–55 %, у микроводорослей — 50–70 %; для сравнения, в зерне пшеницы — 11–14 %, в сое — около 35–40 %.
• Полноценный аминокислотный состав, богатый лизином; много витаминов группы B.
• Скорость: биомасса удваивается за часы, а не за месяцы.
• Независимость от климата и почвы: завод работает круглый год.
• Использование отходов: гидролизатов древесины и соломы, мелассы, молочной сыворотки, отходов спиртового производства, природного газа.

Сравнение «производительности»

Классическое учебное сравнение: бычок массой около 500 кг прибавляет за сутки порядка 0,4–0,5 кг белка в теле, а такая же масса быстро растущих дрожжей при непрерывном выращивании способна синтезировать за сутки сотни килограммов белка и больше. Разница объясняется не только скоростью деления, но и тем, что почти вся масса микробной культуры — «работающие» клетки, тогда как у животного большая часть корма уходит на поддержание жизни, движение и теплообразование.

На чём выращивают кормовой белок

Ограничения

• Нуклеиновые кислоты. Быстро растущие клетки богаты РНК: у бактерий — до 15–20 % сухой массы. У человека при распаде пуринов образуется мочевая кислота; при большом потреблении микробной биомассы она накапливается, что грозит подагрой и камнями в почках. Поэтому для пищи биомассу обрабатывают, снижая содержание нуклеиновых кислот. Для сельскохозяйственных животных, у которых есть фермент, разрушающий мочевую кислоту, это менее важно.
• Клеточная стенка дрожжей и бактерий плохо переваривается; её разрушают.
• Безопасность: в биомассе не должно быть остатков сырья (например, углеводородов) и токсинов; продуцент должен быть безвредным.
• Экономика: микробный белок конкурирует с дешёвой соей и рыбной мукой; при падении цен на сою многие проекты оказались невыгодными.

Как из биомассы делают кормовой продукт

Готовую культуру нужно превратить в сыпучий, безопасный и хорошо усваиваемый продукт. Схема такова.

1. Сгущение. Клетки отделяют от среды на сепараторах или выпариванием — содержание сухих веществ доводят с 2–5 % до 15–20 %.
2. Плазмолиз или разрушение клеток. Нагреванием или механически разрушают клеточные стенки, иначе часть белка останется недоступной для пищеварительных ферментов животного.
3. Снижение содержания нуклеиновых кислот (для пищевых целей): короткое прогревание активирует собственные рибонуклеазы клетки, они расщепляют РНК, и продукты распада вымываются.
4. Сушка — чаще всего распылительная: суспензию распыляют в поток горячего воздуха, и капли мгновенно высыхают, не перегреваясь.
5. Гранулирование, витаминизация, упаковка; контроль состава, влажности и микробиологической чистоты.

Готовый продукт содержит, кроме белка, витамины группы B, минеральные вещества и остатки клеточных стенок, работающие как пищевые волокна.

Микопротеин и белок будущего

Особый случай — микопротеин: мицелий гриба Fusarium venenatum, выращенный на глюкозе в непрерывной культуре. Его нити по структуре напоминают мышечные волокна, поэтому из него делают заменители мяса. Гриб нашли в 1960-х гг. при поиске организмов для пищевого белка в образце почвы из Англии; продукт на его основе продаётся с 1985 г.

Новое направление — белок, выращенный на газах. Бактерии, окисляющие водород, получают энергию из водорода (его можно получать электролизом воды) и строят клетки из CO₂. Такой процесс не требует ни земли, ни сахара, ни света — только электричество, воздух и минеральные соли. Пока это дороже сои, но интерес к нему растёт, в том числе для обеспечения питанием в космосе.

5. Производство аминокислот

Зачем нужны аминокислоты

Из 20 аминокислот белков животные и человек не способны синтезировать девять — их называют незаменимыми; они должны поступать с пищей. В растительных кормах некоторых из них мало: в зерне пшеницы, кукурузы, ячменя первым «кончается» лизин, затем треонин, в бобовых — метионин. Белок корма усваивается организмом только в той мере, в какой хватает самой дефицитной аминокислоты (правило «самой короткой доски бочки»). Если добавить в корм всего несколько килограммов лизина на тонну, усвоение всего белка корма заметно растёт: животные растут быстрее, а на килограмм привеса уходит меньше корма. Кроме того, снижается выделение азота с навозом — это важно для охраны природы.

Какие аминокислоты производят и для чего

Глутамат натрия — соль глутаминовой кислоты, придающая пище вкус «умами» (мясного бульона). Его впервые выделил японский химик К. Икэда из морской водоросли комбу в 1908 г.; первые десятилетия его получали из гидролизата пшеничной клейковины. С конца 1950-х гг., после открытия коринебактерии, выделяющей глутаминовую кислоту [3], почти весь глутамат производят микробиологически — из сахара или мелассы [5].

Как идёт производство

Процесс типичен для микробиологического синтеза: продуцент выращивают в ферментёрах объёмом сотни кубометров на сахаре (глюкозе из крахмала, сахарозе, мелассе) с солями аммония или аммиаком как источником азота при интенсивной аэрации, постепенно подавая сахар. За двое-трое суток в культуральной жидкости накапливается более 100 г аминокислоты на литр. Затем клетки отделяют, аминокислоту выделяют ионообменной хроматографией и кристаллизацией. Для кормов лизин часто выпускают в виде гранул, содержащих и высушенную биомассу продуцента.

Чистота имеет значение

Пример того, почему очистка продукта так важна. В 1989 г. в США вспыхнула эпидемия эозинофилии-миалгии — тяжёлой болезни с мышечными болями и изменениями крови; заболели более полутора тысяч человек, десятки умерли. Её связали с пищевыми добавками триптофана одного японского производителя, который незадолго до этого изменил штамм-продуцент и упростил очистку. Точная причина до конца не установлена; подозревали примеси, образовавшиеся в новом процессе. После этого требования к чистоте аминокислот для пищи и лекарств ужесточились.

6. Производство витаминов

Витамины — вещества, нужные организму в малых количествах для работы ферментов; человек и животные их не синтезируют или синтезируют недостаточно. Многие витамины сегодня получают химически, но для ряда из них микробиологический синтез — единственный или самый выгодный путь.

Витамин B₁₂ (кобаламин)

Самый сложный по строению витамин. Его в природе синтезируют только некоторые бактерии и археи; ни растения, ни животные, ни грибы сделать его не могут. Животные получают B₁₂ от бактерий — у жвачных его образует микрофлора рубца, — а человек с продуктами животного происхождения. Поэтому строгим вегетарианцам нужны добавки B₁₂. Промышленно его получают только микробиологически, с помощью бактерий Pseudomonas denitrificans и пропионовокислых бактерий; в среду добавляют соли кобальта, без которых витамин не образуется [6]. Применяют для лечения анемии, связанной с его недостатком, и в кормах.

Витамин B₂ (рибофлавин)

Жёлто-оранжевое вещество, входящее в коферменты ФАД и ФМН. Природные «сверхпродуценты» — некоторые плесневые грибы, например Ashbya gossypii, паразит хлопчатника, выделяющий рибофлавин в огромных количествах. Сегодня рибофлавин почти полностью получают микробиологически — грибом ашбией и генно-инженерными штаммами сенной палочки. Переход с химического синтеза на микробиологический сократил число стадий, расход сырья и количество отходов [7]. Рибофлавин используют в кормах, как пищевой краситель (Е101) и в медицине.

Витамин C (аскорбиновая кислота)

Классический путь синтеза, предложенный Т. Рейхштейном в 1933 г., химический, но одна его стадия — окисление сорбита в сорбозу — проводится уксуснокислыми бактериями Gluconobacter: химически эту реакцию с нужной точностью провести трудно. В 1970-х гг. в Китае разработали двухстадийный микробиологический процесс, где бактерии выполняют уже две ступени; сегодня он основной. Это пример биотрансформации — сочетания химических и микробиологических стадий.

Провитамины и другие витамины

• β-каротин (провитамин A) получают из гриба Blakeslea trispora и из водоросли дуналиеллы, а также химически.
• Эргостерол дрожжей при облучении ультрафиолетом превращается в витамин D₂; облучённые дрожжи и грибы — его источник.
• Витамин K₂ образуют многие бактерии; богатый источник — натто.
• Пивные и пекарские дрожжи — природный источник витаминов группы B.

7. Органические кислоты и спирты

• Лимонная кислота — продукт аспергилла чёрного; самый массовый органический продукт микробиологического синтеза после этанола: более двух миллионов тонн в год. Используется как подкислитель напитков и кондитерских изделий, консервант, в моющих средствах вместо фосфатов.
• Молочная кислота — продукт молочнокислых бактерий. Кроме пищевого применения, из неё делают полимолочную кислоту — биоразлагаемый пластик для упаковки, одноразовой посуды, медицинских нитей и 3D-печати. Бактерии образуют нужную зеркальную форму кислоты, что важно для свойств пластика.
• Уксусная кислота пищевого назначения — продукт уксуснокислых бактерий.
• Глюконовая кислота — продукт окисления глюкозы аспергиллом; её соли (глюконат кальция) используют в медицине.
• Итаконовая, янтарная кислоты — сырьё для полимеров.
• Этанол — главный по объёму продукт биотехнологии: десятки миллионов тонн в год идут на топливо (в Бразилии — из сахарного тростника, в США — из кукурузы).
• Бутанол и ацетон — продукты клостридий (процесс Вейцмана); сегодня их снова изучают как биотопливо.

8. Антибиотики

Антибиотики — вещества, образуемые микроорганизмами (а также их полусинтетические производные), которые в малых концентрациях подавляют рост других микроорганизмов. В природе они помогают продуценту конкурировать за питание.

Антибиотики — вторичные метаболиты, поэтому их производят в периодическом режиме с подпиткой: сначала наращивают биомассу, затем удерживают культуру в состоянии медленного роста. Многие современные препараты — полусинтетические: природную основу молекулы получают микробиологически, а затем химически или ферментативно присоединяют разные боковые группы. Так из пенициллина получают ампициллин, амоксициллин и другие антибиотики с более широким спектром действия и устойчивостью к кислоте желудка.

Первым отечественным антибиотиком стал грамицидин С («советский»), выделенный Г. Ф. Гаузе и М. Г. Бражниковой в 1942 г. из почвенной бациллы; его применяли для лечения раневых инфекций в годы Великой Отечественной войны. Отечественный пенициллин «крустозин» получила под руководством З. В. Ермольевой в 1942–1943 гг.

Главная проблема — устойчивость бактерий к антибиотикам. Широкое и нередко неправильное применение антибиотиков в медицине и животноводстве отбирает устойчивые штаммы. Поэтому поиск новых антибиотиков и разумное их использование — одна из ключевых задач биотехнологии и медицины.

Как устроен поиск новых антибиотиков сегодня

Почвенные стрептомицеты «отдали» человеку большинство своих антибиотиков ещё в 1940–1960-х гг.: новые образцы почвы снова и снова дают уже известные вещества. Поэтому поиск ведут иначе.

• Необычные места. Морские осадки, пещеры, кишечник насекомых, антарктические почвы — там живут микроорганизмы, не попадавшие в прежние коллекции.
• Невыращиваемые микробы. Большинство почвенных бактерий не растут на обычных средах; для них придумали устройства, где клетки растут прямо в почве, отделённые от неё мембраной, получая природные вещества-сигналы.
• Поиск по генам. В прочитанных геномах находят «молчащие» кластеры генов, похожие на гены синтеза антибиотиков, и включают их, перенося в удобный продуцент.
• Доработка известных молекул. Химическая модификация позволяет обойти механизмы устойчивости бактерий.

Почему это важно: устойчивость бактерий к антибиотикам растёт, а новых классов антибиотиков за последние десятилетия появилось мало. Это одна из серьёзных проблем современной медицины, и решать её будут в том числе средствами биотехнологии.

9. Ферменты

Промышленные ферменты — один из самых быстро растущих продуктов микробиологического синтеза. Большинство из них микроорганизмы выделяют в среду, что упрощает получение.

Ферменты для стиральных порошков — пример того, как биотехнология экономит энергию: они разрушают загрязнения при 30–40 °С, и стирать можно в холодной воде вместо кипячения.

10. Полисахариды и биополимеры

• Ксантан — слизистый полисахарид бактерии Xanthomonas campestris; загуститель для соусов, кетчупа, косметики, буровых растворов.
• Декстран — полисахарид, образуемый бактерией лейконостоком из сахарозы; его растворы (в нашей стране — препараты полиглюкин и реополиглюкин) применяют как кровезаменители при кровопотере.
• Бактериальная целлюлоза — очень чистая и прочная, используется для раневых покрытий и в косметике.
• Полигидроксиалканоаты — запасные вещества многих бактерий, накапливаемые в клетке в виде гранул; из них получают биоразлагаемые пластики.

11. Рекомбинантные белки

Отдельная группа продуктов микробиологического синтеза — белки человека и животных, которые синтезируют генно-инженерные микроорганизмы. В клетку продуцента вводят ген нужного белка, и она производит его наряду со своими белками.

• Инсулин человека — кишечная палочка или дрожжи; применяется при сахарном диабете с 1982 г.
• Соматотропин (гормон роста) — для лечения карликовости, вызванной его недостатком; раньше его выделяли из гипофиза умерших людей, что было опасно передачей прионной болезни.
• Интерфероны — противовирусные и противоопухолевые препараты.
• Вакцина против гепатита B — белок оболочки вируса, синтезируемый дрожжами.
• Ферменты для промышленности — химозин, фитаза и многие другие.

Сложные белки, которым нужны углеводные цепи (эритропоэтин, моноклональные антитела, факторы свёртывания крови), получают уже не в микроорганизмах, а в культурах клеток млекопитающих. Как конструируют таких продуцентов, разбирается в статье серии о генной инженерии.

12. Микробиологический и химический синтез: сравнение

На практике методы сочетают: часть стадий выполняют микроорганизмы или ферменты, часть — химики. Такой подход называют химико-ферментативным или полусинтетическим (витамин C, полусинтетические антибиотики, гормоны-стероиды).

13. Биотрансформация: микробы на службе химиков

Биотрансформация особенно важна в производстве лекарств-стероидов: кортизона, преднизолона, половых гормонов. Химически ввести атом кислорода в строго определённое положение стероидного скелета очень трудно — нужны десятки стадий. В начале 1950-х гг. исследователи обнаружили, что плесневый гриб ризопус за одну стадию гидроксилирует прогестерон в нужном положении. Это резко удешевило кортизон, который до того был одним из самых дорогих лекарств. Сегодня стероидные лекарства получают из растительных стеринов (сои, диоскореи) с участием нескольких микробиологических стадий.

Биотрансформацию применяют и для получения единственной нужной зеркальной формы вещества из смеси: фермент действует только на одну из форм.

14. Технологическая схема микробиологического синтеза

Общая схема производства подробно разобрана в первой статье серии; для продуктов обмена её можно уточнить.

1. Штамм-продуцент из коллекции → наращивание посевного материала.
2. Приготовление и стерилизация среды: источник углерода (сахар, меласса, гидролизат крахмала), азота (аммиак, соли аммония, кукурузный экстракт), минеральные соли, для B₁₂ — соли кобальта.
3. Ферментация: для аминокислот и антибиотиков — с подпиткой сахаром, аэрацией, поддержанием pH аммиаком (он одновременно служит источником азота).
4. Отделение биомассы: центрифугирование, фильтрация.
5. Выделение продукта: из культуральной жидкости (аминокислоты, лимонная кислота, антибиотики, ферменты) или из клеток (B₁₂, некоторые рекомбинантные белки).
6. Очистка: осаждение, экстракция, ионообменная хроматография, кристаллизация.
7. Сушка, стандартизация, упаковка; переработка отходов (биомасса — на корм или удобрение).

Если продукт — сама биомасса (кормовые дрожжи), этапы выделения проще: клетки отделяют, сгущают, подвергают плазмолизу и высушивают.

15. Как развивался микробиологический синтез

• 1910–1920-е — промышленная лимонная кислота (поверхностное выращивание аспергилла); ацетон и бутанол (клостридии).
• 1940-е — пенициллин и глубинное культивирование в ферментёрах с аэрацией; стрептомицин.
• 1950-е — микробиологический синтез витамина B₁₂; биотрансформация стероидов; глутаминовая кислота (1956–1957).
• 1960-е — лизин и другие аминокислоты; кормовые дрожжи на гидролизатах и парафинах; ферменты для моющих средств.
• 1970–1980-е — белок одноклеточных на метаноле и парафинах; иммобилизованные ферменты; глюкозо-фруктозный сироп; первые генно-инженерные продуценты белков.
• 1990-е — наши дни — генно-инженерные продуценты аминокислот, витаминов и ферментов; прочтение геномов продуцентов; синтетическая биология; биопластики; белок на метане и водороде.

В СССР в 1960–1980-х гг. была создана одна из крупнейших в мире микробиологических промышленностей; ею руководило отдельное ведомство — Главмикробиопром. Выпускались кормовые дрожжи, белково-витаминные концентраты, кормовой лизин, ферменты, антибиотики, средства защиты растений. Часть заводов после 1990-х гг. закрылась, но в последние годы в России построены новые производства аминокислот и ферментов.

16. Откуда берутся штаммы-продуценты

Путь от природного микроорганизма до промышленного штамма проходит несколько ступеней; подробно он разобран в статье серии «Доместикация и селекция» о селекции микроорганизмов.

1. Поиск в природе (скрининг). Из почвы, воды, пищевых продуктов выделяют тысячи культур и проверяют, не образует ли какая-нибудь из них нужное вещество. Так были найдены первые продуценты антибиотиков, глутаминовой кислоты, лимонной кислоты.
2. Мутагенез и отбор. Культуру обрабатывают ультрафиолетом или химическими мутагенами и среди множества выживших клеток ищут более продуктивные. Процедуру повторяют много раз; так выход пенициллина подняли в тысячи раз.
3. Отбор на специальных средах. Среды составляют так, чтобы расти могли только клетки с нужными свойствами: например, среда с веществом, похожим на целевую аминокислоту, или среда без неё.
4. Генетические методы. Слияние клеток близких штаммов, введение дополнительных копий генов, перенос генов из других организмов.
5. Испытание в ферментёре. Штамм, хороший в колбе, может оказаться плохим в аппарате: сильно пенится, чувствителен к перемешиванию, требует слишком много кислорода. Поэтому кандидатов проверяют сначала в лабораторных ферментёрах на несколько литров, потом в опытных на несколько кубометров.
6. Хранение. Готовый штамм лиофилизируют или замораживают, чтобы он не менялся.

Современные компании сочетают классическую селекцию с анализом геномов и направленным изменением генов. Нередко оказывается, что в классически отобранном «рекордсмене» накоплены десятки полезных мутаций, смысл которых удаётся понять только после прочтения его генома.

17. Экономика процесса: из чего складывается цена

Почему одни продукты микробиологического синтеза стоят копейки за килограмм, а другие — тысячи рублей за миллиграмм? Главных причин три.

• Концентрация продукта. Лизина в культуральной жидкости накапливается 100–150 г/л, а некоторых рекомбинантных белков — доли грамма на литр. Чем ниже концентрация, тем больше объёма нужно переработать и тем дороже выделение.
• Сложность очистки. Кормовой лизин допустимо выпускать вместе с высушенной биомассой; лекарственный белок должен быть очищен от всех посторонних белков, ДНК и следов среды, а каждая стадия очистки — это потери продукта и затраты.
• Масштаб. Чем крупнее производство, тем меньше доля постоянных затрат. Лимонную кислоту производят миллионами тонн, а редкий фермент для лабораторий — килограммами.

Практическое следствие: усилия разработчиков направлены не только на повышение продуктивности штамма, но и на то, чтобы продукт выделялся в среду (а не накапливался внутри клетки), чтобы культура не пенилась, чтобы процесс шёл при более высокой плотности клеток. Иногда дешевле не повышать выход на 10 %, а упростить одну стадию очистки.

18. Микробиологический синтез и охрана природы

У микробиологической промышленности есть и экологическая сторона — положительная и отрицательная.

Польза:

• сырьём служат возобновляемые ресурсы и отходы — солома, опилки, меласса, сыворотка;
• биоразлагаемые пластики из молочной кислоты и полигидроксиалканоатов заменяют нефтяные полимеры;
• ферменты в моющих средствах позволяют стирать при низкой температуре и заменяют фосфаты, вызывающие «цветение» водоёмов;
• фитаза в кормах высвобождает фосфор растительного сырья, и в навозе его оказывается меньше — меньше загрязнение водоёмов;
• аминокислоты в кормах снижают выделение азота животными.

Проблемы:

• производства потребляют много воды и энергии (аэрация, охлаждение, стерилизация, выпаривание);
• остаются большие объёмы отработанной культуральной жидкости и биомассы, которые нужно перерабатывать;
• выбросы в воздух могут содержать белковую пыль и клетки продуцента — она способна вызывать аллергию у людей, живущих рядом с заводом. Именно такие жалобы, наряду с сомнениями в безопасности белка из парафинов нефти, привели в конце 1980-х гг. к общественным протестам и закрытию части заводов БВК в СССР.

Отсюда требования к современному производству: замкнутые циклы по воде, тонкая очистка воздуха, использование продуцентов с безупречной репутацией и переработка всех отходов.

19. Пенициллин: как рождалась отрасль

История промышленного пенициллина — образец того, как устроено создание биотехнологического производства, поэтому её стоит разобрать подробно.

Наблюдение. В 1928 г. Александр Флеминг, вернувшись из отпуска, заметил, что на одной из чашек с посевом стафилококков выросла плесень, а вокруг неё колонии бактерий растворились. Он выделил гриб, назвал действующее вещество пенициллином, опубликовал работу — и на годы оставил её: выделить вещество в чистом виде не удавалось, оно было нестойким.

Выделение и доказательство. В 1938–1940 гг. в Оксфорде группа Говарда Флори и Эрнста Чейна (в неё входил и Норман Хитли, придумавший способ переводить пенициллин из раствора в раствор и обратно) получила препарат, которого хватило для опытов на мышах. Восьми мышам ввели смертельную дозу стрептококков; четверым, получившим пенициллин, выжили, остальные погибли. Это доказало лечебное действие.

Нехватка вещества. Первому пациенту — полицейскому с тяжёлым заражением крови — пенициллина не хватило: его выделяли даже из мочи больного, чтобы ввести повторно, но запас кончился, и пациент погиб. Стало ясно, что главная задача — не медицина, а технология: нужно производить килограммы вместо миллиграммов.

Технологический прорыв (1941–1945). В США, в лаборатории в Пеории, решили сразу несколько задач:

• нашли дешёвую среду — кукурузный экстракт, отход крахмального производства, резко повышавший выход;
• перешли от поверхностного выращивания в сосудах к глубинному — в больших ферментёрах с мешалкой и стерильной аэрацией; это и стало главным инженерным изобретением отрасли;
• нашли более продуктивный штамм (с заплесневевшей дыни) и начали улучшать его мутагенезом;
• отработали выделение и очистку, стандартизацию активности препарата.

К высадке союзников в Нормандии в 1944 г. пенициллина хватало для армии; за годы войны он спас десятки тысяч жизней. В 1945 г. Флеминг, Флори и Чейн получили Нобелевскую премию.

В СССР препарат пенициллина — «крустозин» — получила в 1942 г. группа Зинаиды Виссарионовны Ермольевой; производство разворачивали в тяжелейших условиях войны. Отечественный антибиотик грамицидин С выделили Г. Ф. Гаузе и М. Г. Бражникова.

Чему учит эта история. Открытие вещества — лишь начало; чтобы оно стало лекарством, нужны продуктивный штамм, дешёвая среда, подходящий аппарат, способ очистки и контроль качества. Именно эти пять задач решает биотехнология для любого продукта.

20. Разбор примера: производство лизина

Проследим весь путь на одном продукте.

1. Зачем. Лизин — первая лимитирующая аминокислота зерновых кормов; его добавляют в комбикорма для свиней и птицы.
2. Продуцент. Коринебактерия или кишечная палочка — штамм, у которого ослаблено подавление синтеза лизина его избытком и усилен вывод лизина из клетки.
3. Сырьё. Глюкоза из крахмала кукурузы или пшеницы, меласса; источник азота — аммиак и соли аммония; минеральные соли; иногда витамины.
4. Ферментация. Объём 100–500 м³, температура около 32 °С, pH поддерживают аммиаком, воздух подают непрерывно, сахар — порциями. 40–60 часов, титр более 100 г/л.
5. Выделение. Клетки отделяют; лизин связывают на ионообменной смоле, снимают раствором, упаривают и кристаллизуют как лизина моногидрохлорид. Для кормовых целей выпускают и жидкий концентрат, и гранулы вместе с биомассой.
6. Контроль. Содержание основного вещества, посторонних аминокислот, влаги, микробиологическая чистота.
7. Отходы. Биомасса и упаренная жидкость идут на корм и удобрения.

Экономика: на тонну лизина расходуется около 2 т сахара, то есть выход порядка 0,5 г/г; крупный завод выпускает десятки тысяч тонн в год. В России заводы по производству кормового лизина построены в 2010-х гг. в Белгородской и Тюменской областях, что снизило зависимость от импорта.

21. Как подбирают промышленный фермент

Фермент для производства должен не просто катализировать нужную реакцию, но и выдерживать условия, в которых ему предстоит работать. Требования к нему во многом те же, что к продуценту.

Если природный фермент почти подходит, его «дорабатывают» направленной эволюцией: в ген вносят случайные изменения, получают тысячи вариантов белка и отбирают те, что лучше работают в нужных условиях. Это лабораторное повторение естественного отбора, только критерий задаёт человек. За развитие этого подхода Фрэнсис Арнольд получила Нобелевскую премию по химии 2018 г. [8]

22. Словарь темы

• Микробиологический синтез — получение веществ с помощью микроорганизмов в промышленных условиях.
• Продуцент — организм, образующий целевой продукт; штамм — его генетически однородная культура.
• Биомасса — масса клеток; белок одноклеточных — кормовой или пищевой белок из биомассы микроорганизмов.
• Первичные метаболиты — вещества, нужные для роста (аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты); вторичные — не нужные для роста (антибиотики, пигменты).
• Незаменимые аминокислоты — аминокислоты, которые организм не синтезирует и должен получать с пищей.
• Биотрансформация — превращение добавленного вещества ферментами клеток в другое вещество.
• Титр — концентрация продукта в культуральной жидкости; выход — граммы продукта на грамм субстрата; производительность — граммы на литр в час.
• Иммобилизованный фермент — фермент, закреплённый на нерастворимом носителе для многократного использования.
• Полусинтетический антибиотик — препарат, у которого природная основа молекулы получена микробиологически, а боковые группы присоединены химически.
• Рекомбинантный белок — белок, синтезируемый клеткой по введённому в неё чужому гену.

23. Витамины: кто и как их получает

Чтобы не путаться, сведём способы получения витаминов в таблицу. В ней видно, что микробиологический синтез занимает не всю область, но там, где молекула сложна, он незаменим.

Закономерность простая: чем сложнее молекула и чем важнее её пространственное строение, тем больше шансов, что промышленность доверит синтез микроорганизму.

24. Закваски, пробиотики и биопрепараты

Не всегда продукт микробиологического производства — вещество. Часто продаются сами живые микроорганизмы.

• Закваски для молочной промышленности, хлебопечения, сыроделия, силосования — концентраты живых бактерий определённых штаммов, замороженные или высушенные. Их выращивают в ферментёрах, концентрируют, смешивают с защитными веществами (сахарами, глицерином) и лиофилизируют.
• Пробиотики — препараты живых микроорганизмов (чаще бифидобактерий и лактобацилл) для восстановления микрофлоры кишечника.
• Бактериальные удобрения — препараты клубеньковых бактерий для бобовых, азотобактера, фосфатмобилизующих бактерий.
• Биологические средства защиты растений — препараты на основе бациллы тюрингской против насекомых, грибов триходермы против возбудителей болезней, вирусов насекомых.
• Препараты для очистки — смеси бактерий, разлагающих нефтепродукты, для биоремедиации; биопрепараты для септиков и компостирования.
• Силосные и кормовые добавки — дрожжи и бактерии, улучшающие пищеварение жвачных.

Главная технологическая трудность здесь — сохранить жизнеспособность клеток при сушке и хранении. Поэтому в препараты добавляют защитные вещества (трегалозу, обезжиренное молоко, глицерин), а срок годности указывают с запасом: количество живых клеток (КОЕ) постепенно снижается.

25. Генно-инженерные продуценты: что это меняет

С 1980-х гг. в промышленности всё чаще работают микроорганизмы, которым введены чужие гены или изменены собственные.

• Появились продукты, которых микроорганизмы не делали вовсе: инсулин человека, соматотропин, интерфероны, химозин телёнка, антигены вирусов для вакцин.
• Выросли выходы «старых» продуктов: современные штаммы продуцентов аминокислот и витаминов получены с участием генной инженерии.
• Сократились стадии и отходы: микробиологический рибофлавин заменил многостадийный химический синтез.
• Стало возможным переносить в удобный продуцент целые цепочки ферментов из других организмов — так дрожжи научили производить предшественник противомалярийного лекарства артемизинина, который раньше получали только из полыни.

Безопасность

Для пищевых и лекарственных продуктов действует правило: в готовом продукте не должно быть ни живых клеток продуцента, ни его ДНК в значимых количествах. Поэтому генно-инженерный химозин или фермент для хлебопечения не делает сыр и хлеб «генетически модифицированными продуктами» — это вещества, полученные с помощью ГМ-микроорганизма, но сами они химически идентичны природным. Производство ведут в закрытых системах, а отработанную биомассу обеззараживают перед утилизацией.

26. Куда движется микробиологический синтез

• Синтетическая биология. Сборка в клетке искусственных цепочек реакций из генов разных организмов, чтобы получать вещества, которые никто в природе не производит в нужных количествах.
• Сырьё без пашни. Использование метана, метанола, водорода и CO₂, отходов лесной промышленности вместо сахара, чтобы не конкурировать с пищевыми культурами за землю.
• Клеточное мясо и белки-заменители. Молочные белки, яичный белок и желатин, синтезируемые дрожжами, уже продаются в ряде стран.
• Биоразлагаемые материалы. Полимеры из молочной кислоты и полигидроксиалканоатов, бактериальная целлюлоза, биопластики из отходов.
• Непрерывные и миниатюрные процессы. Автоматизированные установки, в которых тысячи вариантов штаммов испытываются параллельно в микроферментёрах объёмом в миллилитры.
• Машинное обучение в подборе штаммов. Предсказание, какие изменения генов повысят выход, по накопленным данным о множестве вариантов.

Общее направление — от «нашли в почве и улучшили мутагенезом» к «спроектировали обмен веществ под задачу». Но принципиальная основа остаётся прежней: живая клетка, растущая в ферментёре на дешёвом сырье.

27. Итог: что важно знать

• Микробиологический синтез — промышленное получение веществ с помощью микроорганизмов-продуцентов: биомассы, продуктов обмена, а также биотрансформация готовых веществ.
• Объекты: бактерии (коринебактерии, кишечная палочка, бациллы, молочнокислые, уксуснокислые, псевдомонады, стрептомицеты), дрожжи, мицелиальные грибы (пеницилл, аспергилл, ашбия), микроводоросли, генно-инженерные штаммы.
• Белок одноклеточных (кормовой белок): высокое содержание полноценного белка, быстрый рост, независимость от климата, использование отходов; ограничение — много нуклеиновых кислот.
• Аминокислоты (глутамат, лизин, треонин, триптофан) получают микробиологически: бактерии синтезируют нужную L-форму; лизин повышает усвоение белка кормов.
• Витамины: B₁₂ — только микробиологически (бактерии); B₂ — грибы и бактерии; C — химический синтез с микробиологическими стадиями; β-каротин — грибы и водоросли.
• Продуцент перепроизводит вещество потому, что у него ослаблена нормальная регуляция обмена; такие штаммы получают селекцией и генной инженерией; они нестабильны.
• Другие продукты: органические кислоты (лимонная, молочная), этанол, антибиотики, ферменты, полисахариды, рекомбинантные белки (инсулин, соматотропин, интерфероны).
• Преимущества перед химическим синтезом: мягкие условия, возобновляемое сырьё, синтез сложных молекул и нужных зеркальных форм.

28. Частые ошибки

• «Кормовой белок — это белок, выделенный из корма». Кормовой белок — биомасса микроорганизмов (или белок из неё), выращенная для корма животных.
• «Витамин B₁₂ получают из растений». Растения B₁₂ не синтезируют; его образуют только бактерии и археи.
• «Аминокислоты для кормов получают из мяса». Лизин, треонин, триптофан получают микробиологическим синтезом из сахаров.
• «Микробы выделяют аминокислоты, потому что они им не нужны». Аминокислоты нужны клеткам; выделяют их в больших количествах только отобранные продуценты с нарушенной регуляцией обмена.
• «Антибиотики образуют только грибы». Большинство природных антибиотиков образуют актиномицеты — бактерии; грибы дают пенициллины и цефалоспорины.
• «Лимонную кислоту получают из лимонов». Сегодня её почти всю производит аспергилл чёрный.
• «Микробиологический синтез всегда выгоднее химического». Простые молекулы (метионин, уксусная кислота для промышленности) дешевле получать химически.
• «Микробный белок можно есть без ограничений». Из-за высокого содержания нуклеиновых кислот его для пищи специально обрабатывают.
• «Инсулин производят коровы и свиньи». Сегодня инсулин человека производят генно-инженерные бактерии и дрожжи; животный инсулин почти не используется.

29. Почему это важно знать

Микробиологический синтез — не экзотика, а часть повседневной жизни. Разберём, где школьник встречается с его продуктами.

• В аптеке: антибиотики, витамины B₁₂ и B₂, инсулин, интерфероны, ферментные препараты для пищеварения, пробиотики, кровезаменители на основе декстрана.
• На кухне: лимонная кислота, пищевые кислоты и загустители, глутамат в приправах, ферменты в сыре и соках, дрожжи, закваски.
• В ванной и у стиральной машины: ферменты в порошках и средствах для посудомоечных машин.
• В магазине: продукты животноводства, выращенного на кормах с добавками аминокислот и витаминов; биоразлагаемая упаковка.
• В медицинской лаборатории: ферменты для ПЦР-диагностики, тест-системы с ферментами, питательные среды.

Понимание того, как устроено это производство, помогает трезво оценивать громкие заголовки: что значит «белок из воздуха», опасен ли «глутамат», почему нельзя просто «сделать витамин в пробирке» и почему антибиотики нельзя принимать без назначения врача.

30. Интересные факты

• Мировое производство глутамата натрия и лизина измеряется миллионами тонн в год: это крупнейшие по объёму продукты «тонкой» биотехнологии после этанола и лимонной кислоты.
• Строение витамина B₁₂ установила в середине 1950-х гг. методом рентгеноструктурного анализа Дороти Ходжкин; за работы по строению биологически важных веществ она получила Нобелевскую премию по химии 1964 г.
• Суточная потребность человека в B₁₂ — всего около 2–3 микрограммов, то есть грамм витамина покрыл бы потребность одного человека более чем на тысячу лет.
• Гриб Ashbya gossypii, производящий рибофлавин, поражает хлопчатник; его колонии и среда окрашиваются в ярко-жёлтый цвет из-за избытка витамина.
• В 1950-х гг. японский учёный С. Киносита просмотрел сотни бактериальных культур из почвы в поисках выделяющих аминокислоты; найденная коринебактерия до сих пор — основа отрасли.
• Добавление лизина и других аминокислот в корма позволяет снизить содержание белка в рационе свиней на несколько процентов без потери привеса, а выделение азота с навозом — на десятки процентов.
• До появления рекомбинантного соматотропина его получали из гипофиза умерших; в 1985 г. выяснилось, что так несколько пациентов заразились прионной болезнью Крейтцфельдта — Якоба. Генно-инженерный гормон полностью устранил эту опасность.
• Декстран впервые заметили как «болезнь» сахарного производства: лейконосток превращал сахарный сироп в слизистую массу, забивавшую трубы. Позже это вещество стало ценным кровезаменителем.
• Производство ферментов для стиральных порошков началось после того, как в 1960-х гг. нашли бациллы, чьи протеазы работают в щелочной среде. Сегодня почти в каждом порошке есть несколько ферментов микробного происхождения.
• В ферментёре объёмом 200 м³ помещается примерно столько же жидкости, сколько в бассейне 25 × 8 м глубиной метр; при этом вся она должна оставаться стерильной и равномерно перемешанной.
• Знаменитый лабораторный «рабочий конь» — фермент Taq-полимераза — получают сегодня не из горячих источников, а из генно-инженерной кишечной палочки, которой передали соответствующий ген.

31. Частые вопросы

Почему лизин так важен для кормов?

Лизин — незаменимая аминокислота, которой меньше всего в белке зерна. Организм строит белки только при наличии всех аминокислот; если лизина не хватает, остальные аминокислоты корма не используются для роста, а расщепляются и выводятся. Небольшая добавка лизина позволяет использовать белок корма полнее.

Почему глутамат натрия делают бактерии, а не химики?

Для вкуса нужна только L-форма глутаминовой кислоты; химический синтез даёт смесь L- и D-форм, которую надо разделять. Бактерии сразу образуют L-форму из дешёвого сахара. Это проще и дешевле.

Безопасен ли глутамат натрия?

Глутамат — обычная аминокислота, входящая в состав белков; много свободного глутамата в томатах, пармезане, грибах, соевом соусе. Организм не отличает глутамат из приправы от глутамата из пищи. Международные экспертизы признают его безопасным в обычных количествах; некоторые люди могут ощущать кратковременный дискомфорт при приёме больших доз натощак.

Почему витамин B₁₂ не умеют делать растения и животные?

Путь синтеза B₁₂ включает около 30 ферментативных стадий; гены этих ферментов есть только у части бактерий и архей. Растениям B₁₂ не нужен вовсе — их ферменты работают без него. Животные используют B₁₂, но получают его от бактерий: с пищей или от симбионтов пищеварительного тракта.

Чем микробиологический синтез отличается от брожения?

Брожение — способ получения энергии без кислорода. Микробиологический синтез — производственный процесс, в котором продукт может образовываться и при брожении (этанол, молочная кислота), и при аэробном росте (аминокислоты, лимонная кислота, антибиотики, витамины). Большинство процессов микробиологического синтеза — аэробные.

Можно ли использовать отходы для микробиологического синтеза?

Да, и это одно из главных преимуществ. Меласса, барда, сыворотка, гидролизаты соломы и древесины, отходы переработки фруктов служат сырьём для дрожжей, кормового белка, спирта, органических кислот. Так одновременно решаются две задачи — получение продукта и утилизация отходов.

Почему микробный белок до сих пор не вытеснил сою?

Себестоимость: соя растёт за счёт бесплатной энергии Солнца и азотфиксации клубеньковых бактерий, а ферментёр требует сахара или газа, кислорода, охлаждения, стерильности и электроэнергии. Микробный белок выгоден там, где есть дешёвое сырьё (газ, отходы), или где нужен продукт с особыми свойствами (корм для рыб, пищевые заменители мяса).

Что такое биотрансформация?

Превращение вещества, добавленного в среду, в другое вещество одной или несколькими реакциями, которые проводят ферменты микроорганизма. Сам микроорганизм здесь — «катализатор» одной стадии сложного химического синтеза. Примеры: окисление сорбита в сорбозу при синтезе витамина C, гидроксилирование стероидов.

Почему некоторые лекарства нельзя получить в бактериях, даже зная ген?

Бактерия прочитает ген и построит цепь аминокислот, но не сделает то, что делают клетки человека после синтеза: не присоединит углеводные цепи, не всегда правильно свернёт белок и образует дисульфидные мостики, не разрежет предшественник в нужном месте. Для таких белков (антител, эритропоэтина, факторов свёртывания крови) используют культуры клеток млекопитающих.

Что значит «титр 120 г/л» и почему это много?

Это 120 г продукта в каждом литре культуральной жидкости — почти 12 % по массе. Для сравнения, многие рекомбинантные белки накапливаются в количестве долей грамма на литр. Высокий титр означает, что из одного кубометра жидкости получают больше ста килограммов продукта, и затраты на выделение в расчёте на килограмм невелики.

Можно ли получить антибиотик химически?

Молекулы природных антибиотиков очень сложны, и полный химический синтез обычно невыгоден. Поэтому основу молекулы получают микробиологически, а затем химически или ферментативно видоизменяют — так делают полусинтетические пенициллины и цефалоспорины. Некоторые синтетические антибактериальные вещества (например, сульфаниламиды, фторхинолоны) получают химически, но антибиотиками в строгом смысле их не называют.

32. ЕГЭ

Тема относится к элементу 3.7 кодификатора [1]: «Микробиологический синтез. Объекты микробиологических технологий. Производство белка, аминокислот и витаминов». На экзамене проверяют, знает ли выпускник, что получают с помощью микроорганизмов, и может ли объяснить, почему для этого удобны именно микроорганизмы.

Что обязательно знать

• Определение микробиологического синтеза; понятия продуцент, штамм.
• Продукты: кормовой белок, аминокислоты (лизин, глутаминовая кислота), витамины (B₁₂, B₂, C), органические кислоты, антибиотики, ферменты, гормоны (инсулин).
• Объекты: бактерии, дрожжи, плесневые грибы; примеры соответствия продукта и продуцента.
• Преимущества микробиологического синтеза.
• Значение аминокислот (лизина) для кормов.

Разбор типичных формулировок

«Выберите три продукта, получаемых микробиологическим синтезом». Верные: лизин, витамин B₁₂, кормовой белок, антибиотики, лимонная кислота, ферменты. Ловушки: «крахмал», «сахароза», «целлюлоза хлопка» — их получают из растений.

«Установите соответствие между продуктом и продуцентом». Пенициллин — пеницилл; стрептомицин — стрептомицет; лимонная кислота — аспергилл; кормовой белок — дрожжи; лизин — коринебактерия; инсулин — генно-инженерная кишечная палочка.

Часть 2: «Каковы преимущества получения кормового белка с помощью микроорганизмов?» Элементы ответа: 1) быстрый рост и высокая продуктивность; 2) высокое содержание полноценного белка, богатого незаменимыми аминокислотами, и витаминов; 3) использование дешёвого сырья и отходов; 4) производство не зависит от климата, сезона и площади земли.

Часть 2: «Почему аминокислоты получают микробиологическим, а не химическим синтезом?» Элементы: 1) микроорганизмы синтезируют только L-формы, используемые организмом; 2) химический синтез даёт смесь форм, требующую разделения; 3) микробиологический синтез идёт в мягких условиях на возобновляемом сырье.

33. Для олимпиад

Выход продукта и производительность

Производство оценивают тремя числами: титром (концентрацией продукта в конце процесса, г/л), выходом (граммов продукта на грамм сахара) и производительностью (граммов на литр в час). Все три важны: высокий титр облегчает выделение, высокий выход экономит сырьё, высокая производительность — время работы аппарата.

Пример 1. В ферментёре объёмом 200 м³ (рабочий объём 150 м³) за 60 ч накопилось 120 г/л лизина; израсходовано 36 т сахара. Масса лизина — 120 · 150 000 = 18 т; выход — 18/36 = 0,5 г/г; производительность — 120/60 = 2 г/(л·ч). За год (с учётом подготовки ≈ 100 циклов) один аппарат даст около 1,8 тыс. т лизина.

Принцип «самой короткой доски»

Пусть белок корма содержит 3 % лизина от потребности 5 %, а остальные незаменимые аминокислоты — с избытком. Тогда для синтеза белков тела используется лишь 3/5 = 60 % белка корма (по лизину); остальное сгорает. Добавка лизина до 5 % теоретически позволяет использовать почти весь белок, пока «короткой доской» не станет следующая аминокислота (обычно треонин или метионин). Так объясняется, почему в корма добавляют сразу несколько аминокислот в определённом соотношении.

Нуклеиновые кислоты в микробном белке

Пример 2. Сухая биомасса бактерий содержит 70 % белка и 15 % РНК. Рекомендуемый предел нуклеиновых кислот в рационе взрослого человека — около 2 г в сутки. Сколько белка такой биомассы человек мог бы съесть без обработки? 2 г / 0,15 ≈ 13 г биомассы в сутки — это всего около 9 г белка при потребности 50–70 г. Поэтому для пищевых целей содержание РНК снижают до 1–2 %: тогда предел — уже 100–200 г биомассы.

Почему метан — удобное сырьё для кормового белка

Метанокисляющие бактерии используют метан как источник углерода и энергии. При окислении метана энергии выделяется много, но часть углерода уходит в CO₂: выход биомассы — порядка 0,6–1 г на грамм метана, против 0,5 г на грамм глюкозы у дрожжей. В расчёте на тонну сырья метан выгоднее сахара, но процесс требует очень много кислорода и охлаждения: кислорода нужно больше, чем при росте на сахаре, потому что метан — более восстановленное вещество.

Кобальт и витамин B₁₂

Пример 3. Молекулярная масса цианокобаламина около 1355 г/моль, в молекуле один атом кобальта (59 г/моль). Сколько кобальта нужно на 1 кг витамина? 59/1355 · 1000 ≈ 44 г. Поскольку часть кобальта не усваивается, его вносят в среду с запасом. Недостаток кобальта в почвах и кормах вызывает у жвачных болезнь «сухотку»: бактерии рубца не могут синтезировать B₁₂.

Задача на понимание: почему продуцент нестабилен

Пусть продуктивные клетки растут со скоростью μ₁ = 0,30 ч⁻¹, а мутанты, утратившие перепроизводство, — μ₂ = 0,33 ч⁻¹. В начале доля мутантов 10⁻⁶. Через сколько часов непрерывного роста она достигнет 1 %? Отношение численностей растёт как e^{(μ₂−μ₁)t} = e^0,03t; нужно увеличение в 10⁴ раз: 0,03t = ln 10⁴ ≈ 9,2; t ≈ 307 ч, около 13 суток. Даже небольшое преимущество в скорости роста быстро меняет состав культуры — поэтому процессы с продуцентами не ведут бесконечно и начинают каждый цикл с коллекционной культуры.

34. Задания с разбором

Задание 1

Что такое микробиологический синтез? Приведите четыре примера его продуктов.

Задание 2

Установите соответствие между продуктом и продуцентом: А) пенициллин; Б) лимонная кислота; В) глутаминовая кислота; Г) стрептомицин; Д) рибофлавин. Продуценты: 1) аспергилл; 2) пеницилл; 3) коринебактерия; 4) стрептомицет; 5) гриб ашбия.

Задание 3

Выберите три верных утверждения. 1) Витамин B₁₂ синтезируют растения. 2) Лизин добавляют в корма, так как его мало в зерне. 3) Кормовой белок — биомасса микроорганизмов. 4) Химический синтез аминокислот даёт только L-формы. 5) Микробиологический синтез идёт в мягких условиях. 6) Антибиотики — первичные метаболиты.

Задание 4

Назовите не менее четырёх преимуществ получения кормового белка с помощью микроорганизмов.

Задание 5

Почему добавка небольшого количества лизина в корм заметно повышает привес животных?

Задание 6

Почему витамин B₁₂ получают только микробиологическим синтезом?

Задание 7

Почему микробный белок для питания человека нужно специально обрабатывать?

Задание 8

Найдите ошибки и исправьте: 1) Лимонную кислоту получают из лимонов. 2) Глутамат натрия получают с помощью коринебактерий. 3) Стрептомицин образуют плесневые грибы. 4) Инсулин человека синтезируют генно-инженерные бактерии. 5) Метионин для кормов получают только микробиологически.

Задание 9

Что такое биотрансформация? Приведите пример.

Задание 10

Почему продуценты аминокислот нестабильны и их нельзя бесконечно пересевать?

Задание 11

Сравните микробиологический и химический синтез по трём признакам.

Задание 12

Почему антибиотики производят в периодическом режиме с подпиткой, а не в непрерывной культуре?

Задание 13

Какие вещества получают с помощью аспергилла чёрного?

Задание 14

Почему растворы декстрана используют как кровезаменитель?

Задание 15

Установите соответствие между продуктом и группой: А) лизин; Б) пенициллин; В) рибофлавин; Г) лимонная кислота; Д) амилаза. Группы: 1) аминокислота; 2) антибиотик; 3) витамин; 4) органическая кислота; 5) фермент.

Задание 16

Зачем в среду для получения витамина B₁₂ добавляют соли кобальта?

Задание 17

Почему ферменты в стиральных порошках экономят энергию?

Задание 18

Почему соматотропин человека сегодня получают с помощью генно-инженерных бактерий, а не из гипофиза?

Задание 19 (олимпиадное)

За цикл 50 ч в 100 м³ культуральной жидкости накопилось 110 г/л глутаминовой кислоты; израсходовано 20 т глюкозы. Рассчитайте массу продукта, выход (г/г) и производительность (г/(л·ч)). Теоретический максимум выхода — около 0,82 г/г. Какую долю от него составляет полученный выход?

Задание 20 (олимпиадное)

Сухая биомасса дрожжей содержит 50 % белка и 10 % РНК. Предел нуклеиновых кислот в пище — 2 г в сутки. Сколько граммов белка дрожжей можно съесть без обработки? До какого процента нужно снизить содержание РНК, чтобы человек мог получать из дрожжей 30 г белка в сутки?

Литература

1. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.
2. Kalinowski J., Bathe B., Bartels D. et al. The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins // Journal of Biotechnology. 2003. Vol. 104, № 1–3. P. 5–25. DOI: 10.1016/S0168-1656(03)00154-8.
3. Kinoshita S., Udaka S., Shimono M. Studies on the amino acid fermentation. Part I. Production of L-glutamic acid by various microorganisms // The Journal of General and Applied Microbiology. 1957. Vol. 3, № 3. P. 193–205. DOI: 10.2323/jgam.3.193.
4. Ritala A., Häkkinen S. T., Toivari M., Wiebe M. G. Single cell protein — state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001–2016 // Frontiers in Microbiology. 2017. Vol. 8. Art. 2009. DOI: 10.3389/fmicb.2017.02009.
5. Hermann T. Industrial production of amino acids by coryneform bacteria // Journal of Biotechnology. 2003. Vol. 104, № 1–3. P. 155–172. DOI: 10.1016/S0168-1656(03)00149-4.
6. Martens J.-H., Barg H., Warren M. J., Jahn D. Microbial production of vitamin B12 // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. Vol. 58, № 3. P. 275–285. DOI: 10.1007/s00253-001-0902-7.
7. Schwechheimer S. K., Park E. Y., Revuelta J. L., Becker J., Wittmann C. Biotechnology of riboflavin // Applied Microbiology and Biotechnology. 2016. Vol. 100, № 5. P. 2107–2119. DOI: 10.1007/s00253-015-7256-z.
8. Arnold F. H. Directed evolution: bringing new chemistry to life // Angewandte Chemie International Edition. 2018. Vol. 57, № 16. P. 4143–4148. DOI: 10.1002/anie.201708408.