Микроорганизмы как объекты биотехнологии

Бактерии, дрожжи, плесневые грибы, микроскопические водоросли — главные «работники» биотехнологии. Они пекут хлеб и квасят молоко, синтезируют антибиотики и витамины, производят инсулин и очищают сточные воды. Чтобы понимать, почему для одного продукта берут бактерию, а для другого — гриб, нужно знать, как эти организмы устроены, чем питаются, как растут в культуре и как из природного микроба получают промышленный штамм. Это вторая статья серии «Биотехнология».

• 1. Кто такие микроорганизмы
• 2. Бактерии — продуценты
• 3. Археи
• 4. Дрожжи
• 5. Мицелиальные (плесневые) грибы
• 6. Микроводоросли и цианобактерии
• 7. Вирусы как инструменты
• 8. Чем питаются микроорганизмы
• 9. Как микроорганизмы получают энергию
• 10. Как растёт культура: четыре фазы
• 11. Питательные среды
• 12. Чистая культура и асептика
• 13. Как люди научились работать с микробами
• 14. Каким должен быть промышленный продуцент
• 15. Как получают промышленный штамм
• 16. Бактерии, дрожжи, грибы, водоросли: сравнение
• 17. Как выбирают продуцента: четыре примера
• 18. Безопасность продуцентов
• 19. Микроорганизмы внутри нас: пробиотики
• 20. Микроорганизмы в экологической биотехнологии
• 21. Три знаменитых штамма
• 22. Словарь темы
• 23. Итог: что важно знать
• 24. Частые ошибки
• 25. Интересные факты
• 26. Частые вопросы
• 27. ЕГЭ
• 28. Для олимпиад
• 29. Задания с разбором
• Литература

1. Кто такие микроорганизмы

Микроорганизмы (микробы) — организмы, которые по отдельности можно разглядеть только в микроскоп. Это не систематическая группа, а сборное понятие: сюда попадают представители разных царств и даже доменов жизни.

Кодификатор говорит о микроорганизмах как об «объектах микробиологических технологий» [1]. На практике основные промышленные продуценты — бактерии и грибы; водоросли используют реже, а вирусы — в основном как инструменты генной инженерии и для производства вакцин.

Прокариоты и эукариоты: что это значит для технолога

Различие в строении клеток определяет, что может и чего не может продуцент.

• У прокариот (бактерий и архей) нет ядра; кольцевая хромосома лежит в цитоплазме, гены часто собраны в опероны и работают совместно. Помимо хромосомы бывают плазмиды — небольшие кольцевые молекулы ДНК, которые легко выделить, изменить и вернуть в клетку. Транскрипция и трансляция идут одновременно. Нет мембранных органоидов, поэтому сложная обработка белков (присоединение углеводов) в основном невозможна. Зато прокариоты растут быстрее всех.
• У эукариот (грибов, водорослей) есть ядро, эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджи, митохондрии. Белки, образуемые на шероховатой ЭПС, проходят сложную обработку и выводятся из клетки. Поэтому дрожжи могут производить белки человека, которые не получаются в бактериях. Гены эукариот содержат интроны; если ген человека вводят в бактерию, используют его вариант без интронов, полученный на основе мРНК.

Почему микроорганизмы так разнообразны

Микробы появились на Земле больше 3,5 млрд лет назад и за это время освоили все среды: горячие источники, ледники, солёные озёра, глубины океана, кишечник животных, поверхность листьев, толщу горных пород. В каждой среде отбор создавал свой набор ферментов. Для биотехнологии это кладовая: ищите фермент, работающий при 90 °С, — найдёте его у обитателей гейзеров; нужен фермент, расщепляющий жиры в холодной воде, — у морских бактерий; нужен организм, окисляющий нефть, — в почве у нефтепромысла.

Знаменитый пример — бактерия Thermus aquaticus, выделенная в 1960-х гг. из горячих источников Йеллоустонского национального парка [2]. Её ДНК-полимераза выдерживает почти кипячение [3]; именно она сделала возможной полимеразную цепную реакцию (ПЦР), без которой немыслимы сегодня ни генная инженерия, ни диагностика инфекций, ни криминалистика.

2. Бактерии — продуценты

Бактерии — самая многочисленная группа промышленных микроорганизмов. Разберём главные группы, которые встречаются в учебниках и на экзамене.

Молочнокислые бактерии

Неподвижные бактерии в форме палочек (лактобациллы) или кокков (лактококки, стрептококки). Получают энергию молочнокислым брожением: сбраживают сахара до молочной кислоты. Кислород им не нужен, но и не убивает их — они устойчивы к его присутствию. Требовательны к питанию: им нужны готовые аминокислоты и витамины, поэтому в природе они живут там, где много питательных веществ, — в молоке, на растениях, в кишечнике.

Применение: кисломолочные продукты (кефир, йогурт, ряженка, творог, сметана), сыры, квашеная капуста и солёные огурцы, силос для скота, закваски для ржаного хлеба, пробиотики, промышленная молочная кислота. Молочная кислота снижает pH, подавляя гнилостные и болезнетворные бактерии, — в этом смысл заквашивания как способа консервирования.

Уксуснокислые бактерии

Палочки родов Acetobacter и Gluconobacter. Строгие аэробы: окисляют этиловый спирт до уксусной кислоты кислородом воздуха. Это не брожение, а неполное окисление. Именно поэтому вино, оставленное открытым, «скисает» в уксус. Применяют для получения пищевого уксуса; родственные бактерии используют для получения аскорбиновой кислоты (одна из стадий синтеза витамина C) и для производства бактериальной целлюлозы.

Кишечная палочка

Escherichia coli — главный организм молекулярной биологии и генной инженерии. Растёт на простой среде, делится примерно раз в 20 минут, её генетика изучена лучше, чем у любого другого организма. Лабораторные штаммы безопасны. В ней получают инсулин человека, гормон роста, интерфероны, многие ферменты для лабораторий, плазмиды и фрагменты ДНК.

Бациллы

Палочковидные почвенные бактерии рода Bacillus, образующие споры — покоящиеся формы, переносящие высушивание и кипячение. Сенная палочка (B. subtilis) и её родственники выделяют в среду большие количества ферментов — протеаз и амилаз, — которые идут в стиральные порошки, текстильную и пищевую промышленность. Бацилла B. thuringiensis образует белковые кристаллы, ядовитые для гусениц бабочек и личинок некоторых жуков, но безвредные для позвоночных; на её основе делают биологические инсектициды, а гены этих белков (Bt-гены) встроены в генно-инженерные сорта кукурузы и хлопчатника.

Коринебактерии

Corynebacterium glutamicum — почвенная бактерия, открытая в Японии в 1950-х гг. Природные штаммы выделяют в среду глутаминовую кислоту. Улучшенные мутагенезом и генной инженерией штаммы — главные продуценты глутамата натрия и кормового лизина, необходимой для животных аминокислоты, которой мало в зерне.

Актиномицеты (стрептомицеты)

Почвенные бактерии рода Streptomyces необычны: они растут ветвящимися нитями, похожими на мицелий грибов, и образуют споры на воздушных нитях. Характерный запах свежевскопанной земли — это летучее вещество геосмин, выделяемое в том числе стрептомицетами. Стрептомицеты — продуценты большей части известных природных антибиотиков: стрептомицина, тетрациклинов, эритромицина, а также противоопухолевых и противогрибковых веществ.

Клостридии

Спорообразующие строгие анаэробы рода Clostridium. Кислород для них ядовит. Одни виды сбраживают крахмал и сахара до ацетона и бутанола (процесс Вейцмана), другие участвуют в вымачивании льна и в разложении органики в метантенках. Среди клостридий есть и опасные возбудители — столбняка, ботулизма, газовой гангрены, поэтому с ними работают осторожно.

Другие полезные бактерии

• Клубеньковые бактерии (ризобии) и азотобактер связывают атмосферный азот; на их основе выпускают бактериальные удобрения (нитрагин и другие).
• Агробактерии (Agrobacterium tumefaciens) в природе переносят часть своей плазмиды в клетки растений и вызывают опухоли; генные инженеры превратили их в главный способ доставки генов в растения.
• Ксантомонады образуют слизистый полисахарид ксантан — загуститель для соусов, кремов, буровых растворов.
• Псевдомонады разлагают нефть, пестициды и другие загрязнители; их используют при очистке почв и вод.
• Пропионовокислые бактерии образуют пропионовую кислоту и углекислый газ при созревании швейцарских сыров (отсюда «глазки» в сыре) и являются промышленными продуцентами витамина B₁₂.
• Железо- и сероокисляющие бактерии (ацидитиобациллы) — хемосинтетики, окисляющие сульфиды металлов; их используют для бактериального выщелачивания меди и золота.

3. Археи

Археи похожи на бактерий внешне, но отличаются строением мембран, клеточной стенки, аппаратом транскрипции и трансляции. Многие из них — экстремофилы: живут при температуре выше 80 °С, в насыщенных растворах соли, в очень кислой среде. В биотехнологии важны две роли архей:

• метанообразующие археи — последнее звено разложения органики без кислорода; в метантенках и биогазовых установках они превращают уксусную кислоту, водород и углекислый газ в метан;
• источник термостабильных ферментов — например, ДНК-полимераз для ПЦР, которые работают точнее Taq-полимеразы.

4. Дрожжи

Дрожжи — одноклеточные грибы, размножающиеся главным образом почкованием. Это не систематическая группа: одноклеточный образ жизни возник у разных грибов независимо. Самые важные дрожжи — Saccharomyces cerevisiae, пекарские, пивные и винные (название означает «сахарный гриб пива»).

Чем дрожжи удобны:

• это факультативные анаэробы: с кислородом они дышат и быстро растут, без кислорода — сбраживают сахар в спирт и углекислый газ;
• они эукариоты и способны правильно обрабатывать многие белки — присоединять к ним углеводы, выводить их из клетки;
• они безопасны и тысячелетиями используются в пище;
• генетика пекарских дрожжей изучена почти так же хорошо, как у кишечной палочки; это первый эукариот, геном которого прочитан полностью (1996 г.);
• дрожжи могут жить и размножаться как в гаплоидном, так и в диплоидном состоянии, что удобно для генетических опытов.

Что получают с помощью дрожжей: хлеб, вино, пиво, спирт (в том числе топливный этанол), кормовой белок, витамины группы B (пивные дрожжи), рекомбинантные белки — вакцину против гепатита B, часть производимого в мире инсулина.

Кроме сахаромицетов используют и другие дрожжи. Komagataella (прежнее название — Pichia pastoris) растёт на метаноле и образует огромные количества чужеродных белков — это одна из самых популярных систем для их производства [4]. Кормовые дрожжи рода Candida (некоторые виды теперь отнесены к другим родам) растут на гидролизатах древесины и отходах; Kluyveromyces сбраживают лактозу молочной сыворотки; Yarrowia накапливает жиры и используется для получения жирных кислот.

5. Мицелиальные (плесневые) грибы

Мицелиальные грибы растут разветвлёнными нитями — гифами, образующими мицелий, и размножаются спорами. В природе они разлагают растительные остатки, поэтому выделяют в среду мощные ферменты — расщепляющие крахмал, целлюлозу, пектин, белки. Многие образуют антибиотики, которыми подавляют конкурирующих бактерий.

Мицелиальные грибы сложнее для промышленности, чем бактерии и дрожжи: мицелий делает культуральную жидкость вязкой, затрудняет перемешивание и снабжение кислородом. Технологи подбирают условия, при которых гриб растёт мелкими шариками (пеллетами), а не сплошным войлоком.

6. Микроводоросли и цианобактерии

Микроводоросли и цианобактерии — фотосинтезирующие микроорганизмы. Им нужны свет, углекислый газ, вода и минеральные соли — дорогой органический субстрат не требуется. Их биомасса богата белком, витаминами, пигментами [5].

• Хлорелла — зелёная одноклеточная водоросль, белок которой составляет до половины сухой массы; её выращивали как добавку к кормам и пище, изучали как источник пищи и кислорода в замкнутых системах жизнеобеспечения космических кораблей.
• Спирулина (род Arthrospira) — нитчатая цианобактерия из щелочных озёр Африки и Мексики; содержит до 60–70 % белка; продаётся как пищевая добавка; пигмент фикоцианин используют как синий пищевой краситель.
• Дуналиелла — водоросль солёных озёр, накапливающая β-каротин (предшественник витамина A) в количествах до 10 % сухой массы.
• Гематококк — источник астаксантина, красного пигмента для кормов в рыбоводстве (он придаёт мясу лосося розовый цвет) и пищевых добавок.

Слабое место водорослей — свет: в густой культуре нижние слои оказываются в тени. Поэтому их выращивают в открытых мелких бассейнах или в прозрачных трубчатых фотобиореакторах, что дороже, чем ферментация бактерий.

7. Вирусы как инструменты

Вирусы — неклеточные формы жизни, размножающиеся только внутри клеток. Сами по себе они не продуценты, но в биотехнологии незаменимы:

• Вакцины: ослабленные или убитые вирусы выращивают в культурах клеток или в куриных эмбрионах.
• Векторы: из вирусов удаляют гены, отвечающие за размножение и болезнь, и вставляют нужный ген; такой вирус доставляет ген в клетку. Так устроены векторные вакцины (на основе аденовирусов) и многие препараты генной терапии.
• Бактериофаги (вирусы бактерий) — модели для генетики, источники ферментов, а также средства лечения инфекций, устойчивых к антибиотикам (фаготерапия), и обеззараживания продуктов.
• Бакуловирусы насекомых используют для производства белков в клетках насекомых и как биологические средства против вредителей леса и сада.

Вирусы — одновременно и угроза биотехнологии: бактериофаги, попавшие в ферментёр, могут погубить культуру бактерий-продуцентов, например закваску на молочном заводе. Поэтому заквасочные штаммы отбирают на устойчивость к фагам и регулярно меняют.

8. Чем питаются микроорганизмы

Чтобы вырастить микроорганизм, надо знать, что ему нужно. Микроорганизмы классифицируют по двум признакам: откуда берут энергию и откуда берут углерод.

Почти все промышленные продуценты — хемогетеротрофы: им дают сахар, крахмал, мелассу, спирт, жиры. Микроорганизмы, которые живут за счёт мёртвого органического вещества, называют сапротрофами; на них и держится микробиологическая промышленность.

Что ещё нужно клетке

• Азот — для белков и нуклеиновых кислот: соли аммония, нитраты, мочевина, аминокислоты; клубеньковые бактерии и азотобактер могут брать азот из воздуха.
• Фосфор — для нуклеиновых кислот, АТФ, фосфолипидов: фосфаты.
• Сера — для аминокислот цистеина и метионина: сульфаты.
• Калий, магний, кальций, железо и микроэлементы (цинк, марганец, медь, кобальт, молибден) — кофакторы ферментов.
• Факторы роста — витамины, аминокислоты, азотистые основания, которые сам организм синтезировать не может. Молочнокислые бактерии требуют многих факторов роста, кишечная палочка — ни одного: она растёт на глюкозе и минеральных солях.

Отношение к кислороду

• Облигатные (строгие) аэробы живут только с кислородом: уксуснокислые бактерии, многие грибы, стрептомицеты.
• Облигатные анаэробы гибнут в присутствии кислорода: клостридии, метанообразующие археи.
• Факультативные анаэробы могут жить и с кислородом, и без него: дрожжи, кишечная палочка.
• Аэротолерантные анаэробы кислород не используют, но переносят его: молочнокислые бактерии.

От этого зависит устройство производства: для аэробов нужна мощная аэрация, для анаэробов — герметичные аппараты, из которых удалён воздух.

Температура и кислотность

По отношению к температуре различают психрофилов (лучше всего растут ниже 15–20 °С), мезофилов (20–45 °С — большинство продуцентов) и термофилов (выше 45 °С, а гипертермофилы — выше 80 °С). Термофилы ценны тем, что их ферменты работают при высокой температуре, а процесс с ними меньше рискует загрязнением посторонними микробами. Например, болгарская палочка и термофильный стрептококк, сквашивающие молоко для йогурта, лучше всего работают при 40–45 °С.

Большинство бактерий предпочитают нейтральную среду (pH 6,5–7,5), грибы — слабокислую (pH 4–6). На этом основан приём: чтобы подавить бактерии при выращивании гриба, среду подкисляют. И наоборот, молочнокислые бактерии сами закисляют среду и тем самым вытесняют конкурентов.

9. Как микроорганизмы получают энергию

Для технолога важно не только чем питается микроб, но и куда «уходит» сахар. Это зависит от способа получения энергии.

Аэробное дыхание

Глюкоза полностью окисляется до углекислого газа и воды; конечный акцептор электронов — кислород. Энергетический выход высок, поэтому много сахара превращается в биомассу. Так растут кормовые и пекарские дрожжи, плесневые грибы, стрептомицеты.

C₆H₁₂O₆ + 6O₂ → 6CO₂ + 6H₂O

Брожение

Без кислорода органическое вещество расщепляется не полностью; электроны «сбрасываются» на органическую молекулу, образованную из самого субстрата. АТФ образуется мало (обычно 2 молекулы на глюкозу), а в среде накапливаются продукты брожения — их-то человек и использует.

Брожение называют по главному продукту, а не по возбудителю. Подробно химия брожения разобрана в статье серии о традиционной биотехнологии.

Неполное окисление

Некоторые аэробы окисляют субстрат кислородом не до конца, выделяя в среду промежуточный продукт. Уксуснокислые бактерии окисляют этанол до уксусной кислоты: C₂H₅OH + O₂ → CH₃COOH + H₂O. Аспергилл при избытке сахара и недостатке марганца и железа выделяет лимонную кислоту — промежуточный продукт цикла Кребса. Это не брожения, хотя исторически их иногда называли «уксуснокислым брожением» и «лимоннокислым брожением».

10. Как растёт культура: четыре фазы

Если засеять бактерии или дрожжи в колбу со свежей средой и ничего больше не добавлять (периодическая культура), число клеток меняется по характерной кривой. Её подробно описал французский микробиолог Жак Моно в 1940-х гг. [6]. На графике, где по вертикали откладывают логарифм числа клеток, а по горизонтали — время, выделяют четыре фазы.

1. Лаг-фаза (фаза задержки)

Клетки только что попали в новые условия. Число их почти не растёт, но внутри идёт перестройка: синтезируются ферменты для использования новых веществ среды, накапливаются рибосомы, клетки увеличиваются в размерах. Чем сильнее отличаются новые условия от прежних и чем старше была посевная культура, тем дольше лаг-фаза. Если засевать молодыми активными клетками в такую же среду, лаг-фаза почти исчезает — поэтому на заводе посевной материал готовят в той же среде и берут в фазе активного роста.

2. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза

Клетки делятся с постоянной максимальной скоростью: за каждое время удвоения их число увеличивается вдвое. На логарифмическом графике это прямая. В этой фазе клетки самые активные и однородные, в них больше всего образуются первичные метаболиты — аминокислоты, нуклеотиды, ферменты роста. Именно в экспоненциальной фазе бактерии наиболее чувствительны к антибиотикам, действующим на синтез клеточной стенки.

3. Стационарная фаза

Питательные вещества истощаются, накапливаются продукты обмена (кислоты, спирты), падает концентрация кислорода. Число новых клеток уравновешивается числом погибших, общее число живых клеток остаётся почти постоянным. Клетки переключаются на «экономный режим», и именно в этой фазе многие микроорганизмы начинают образовывать вторичные метаболиты — антибиотики, пигменты, а бациллы — споры. Поэтому при производстве антибиотиков процесс ведут так, чтобы как можно дольше удерживать культуру в состоянии медленного роста, подкармливая её небольшими порциями сахара.

4. Фаза отмирания

Клетки гибнут быстрее, чем образуются новые, часть разрушается (лизируется). В производстве до этой фазы обычно не доводят — продукт выделяют раньше.

Что ограничивает рост

Моно показал, что скорость роста зависит от концентрации того питательного вещества, которого не хватает (лимитирующего субстрата). Пока его много, клетки растут с максимальной скоростью; когда его концентрация падает, рост замедляется. При этом количество выросшей биомассы пропорционально количеству израсходованного субстрата — коэффициент пропорциональности называют экономическим коэффициентом или выходом биомассы. Это позволяет заранее рассчитать, сколько сахара нужно для получения тонны дрожжей.

Непрерывная культура

Чтобы удерживать клетки в экспоненциальной фазе бесконечно долго, используют непрерывное культивирование: свежую среду постоянно подают, а часть культуры отводят. В хемостате скорость роста культуры задаёт сам технолог — скоростью подачи среды. Такой режим выгоден для получения биомассы и первичных метаболитов, но плох для вторичных: им нужна стационарная фаза. Кроме того, при долгом непрерывном процессе возрастает риск появления мутантов, которые растут быстрее, но продукт образуют хуже, и риск заражения.

Синхронная и колониальная жизнь

В обычной культуре клетки делятся вразнобой. На плотной среде одна клетка за сутки-двое образует колонию — видимое глазом скопление из миллионов потомков. По форме, цвету, краю колонии микробиологи различают виды; а то, что колония — потомство одной клетки, позволяет выделить чистую культуру.

11. Питательные среды

Питательная среда — смесь веществ, в которой выращивают микроорганизмы или клетки. Среды различают по нескольким признакам.

• По консистенции: жидкие (бульоны) — для накопления биомассы и продуктов; плотные — для получения колоний и выделения чистых культур. Плотность придают агаром — полисахаридом из красных водорослей, который застывает при температуре около 40 °С и не разжижается до 85 °С, а главное — почти не разлагается микроорганизмами. Агар в микробиологию ввела Фанни Гессе, жена и сотрудница одного из учеников Роберта Коха: она знала его по приготовлению желе.
• По составу: натуральные (мясной бульон, пивное сусло, отвар картофеля, молоко) — состав точно не известен; синтетические — из известных химически чистых веществ, точно заданных количеств; полусинтетические — смешанного состава.
• По назначению: универсальные — на них растут многие микроорганизмы; элективные (избирательные) — благоприятны для одной группы и подавляют другие (например, среда без азота выделяет азотфиксаторов, среда с нефтью — бактерий, разлагающих нефть); дифференциальные — позволяют различить микроорганизмы по изменению цвета среды или колоний.

В промышленности используют дешёвые натуральные компоненты: мелассу (тёмную патоку — отход сахарного производства, содержащую около половины сахарозы), кукурузный экстракт (отход производства крахмала), соевую муку, гидролизаты древесины и соломы, молочную сыворотку, крахмал. Стоимость среды часто составляет большую часть себестоимости продукта, поэтому выгоднее всего продуценты, растущие на отходах.

12. Чистая культура и асептика

Промышленность почти всегда работает с чистой культурой — потомством одной клетки. Иначе невозможно гарантировать, что продукт будет одинаковым от партии к партии и не будет содержать вредных примесей.

Как выделяют чистую культуру

Метод разработал во второй половине XIX в. Роберт Кох. Материал (почву, воду, продукт) разводят стерильной водой и рассевают по поверхности плотной среды. При достаточном разведении клетки попадают на чашку поодиночке, и каждая даёт отдельную колонию. Колонию переносят петлёй на свежую среду — получают чистую культуру. Проверяют её под микроскопом и повторным рассевом.

Простейший способ рассева — штрихом: петлёй с материалом проводят по поверхности агара несколько серий штрихов, каждый раз прожигая петлю; к последним штрихам клетки рассеиваются настолько, что колонии растут поодиночке.

Стерилизация и асептика

Стерилизация — полное уничтожение всех микроорганизмов, включая споры. Основной способ — нагревание паром под давлением в автоклаве: при 121 °С и избыточном давлении около 1 атм за 15–20 минут гибнут даже споры бацилл. Посуду стерилизуют сухим жаром (160–180 °С), растворы чувствительных веществ — фильтрованием через мембраны с порами 0,2 мкм, которые задерживают бактерии; воздух для ферментёров — через фильтры.

Асептика — комплекс приёмов, не дающих посторонним микробам попасть в культуру: работа у пламени горелки или в ламинарном боксе со стерильным потоком воздуха, прожигание петли, обработка рук и поверхностей. В промышленности этому соответствует строгий режим стерильности ферментёров, трубопроводов, воздуха.

Отличайте стерилизацию от пастеризации (прогревания до 60–90 °С, губящего вегетативные клетки, но не споры) и от дезинфекции (уничтожения болезнетворных микроорганизмов на поверхностях химическими средствами).

Можно ли без чистой культуры

Есть важные исключения, где работают со смешанными культурами — устойчивыми сообществами нескольких видов:

• кефирные грибки — сообщество молочнокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и дрожжей, скреплённое полисахаридом;
• закваски для ржаного хлеба — молочнокислые бактерии и дрожжи;
• «чайный гриб» (комбуча) — дрожжи и уксуснокислые бактерии с плёнкой бактериальной целлюлозы;
• активный ил очистных сооружений и сообщества метантенков — десятки и сотни видов, каждый выполняет свою часть работы.

В таких сообществах виды дополняют друг друга: одни расщепляют сложные вещества, другие используют продукты первых, третьи удаляют то, что тормозит рост. Воспроизвести такое сообщество из чистых культур трудно, поэтому его поддерживают «пересевом» самого сообщества.

13. Как люди научились работать с микробами

Методы, о которых шла речь, появились не сразу. За ними стоят несколько поколений исследователей.

• Антони ван Левенгук (XVII в.) — голландский торговец сукном, шлифовавший линзы. Его простые микроскопы увеличивали примерно в 200–300 раз; в письмах Лондонскому королевскому обществу он описал простейших, бактерии из зубного налёта, сперматозоиды.
• Луи Пастер (XIX в.) доказал, что брожения и гниение вызываются микроорганизмами и что микробы не зарождаются самопроизвольно: в колбе с S-образным горлышком прокипячённый бульон оставался прозрачным, пока пыль из воздуха не попадала в него. Отсюда родились принципы стерилизации и асептики.
• Роберт Кох (вторая половина XIX в.) ввёл плотные питательные среды, окраску бактерий, микрофотографию, разработал метод чистых культур; открыл возбудителей сибирской язвы, туберкулёза, холеры. Его ассистент Юлиус Петри предложил плоскую стеклянную чашку с крышкой, которой пользуются до сих пор.
• Сергей Николаевич Виноградский открыл хемосинтез (1887) у серобактерий, затем нитрифицирующих бактерий; предложил метод элективных культур — создание условий, в которых преимущество получает нужная группа микробов. Его «колонка Виноградского» — стеклянный цилиндр с илом, водой и добавками, в котором за несколько недель возникают цветные слои разных бактерий, — классическая модель микробного сообщества.
• Мартинус Бейеринк развил метод накопительных культур, выделил клубеньковые бактерии и азотобактер, а также ввёл понятие «вирус» для возбудителя мозаичной болезни табака, проходящего через бактериальные фильтры (независимо от Д. И. Ивановского, открывшего это явление в 1892 г.).

Если Пастер ответил на вопрос «что делают микробы», то Кох дал инструмент «как получить один вид», а Виноградский и Бейеринк — «как найти в природе нужную группу». На этих трёх опорах и стоит поиск продуцентов.

14. Каким должен быть промышленный продуцент

Не каждый микроорганизм, способный образовать нужное вещество, годится для завода. К промышленному продуценту предъявляют целый список требований.

Ни один природный микроорганизм не отвечает всем требованиям сразу. Поэтому продуценты получают селекцией — о ней подробно рассказано в статье серии «Доместикация и селекция» о селекции микроорганизмов. Здесь кратко напомним её этапы.

15. Как получают промышленный штамм

Поиск в природе (скрининг)

Образцы почвы, воды, гниющих растений, продуктов брожения рассевают на элективные среды. Например, чтобы найти продуцентов антибиотиков, колонии почвенных микробов выращивают рядом с тестовой бактерией и ищут те, вокруг которых тестовая бактерия не растёт (зона подавления). Так в середине XX в. проверили сотни тысяч почвенных образцов и нашли большинство известных антибиотиков.

Мутагенез и отбор

Природный штамм обрабатывают мутагенами — ультрафиолетом, рентгеновскими лучами, химическими веществами, — чтобы повысить частоту мутаций. Большинство мутантов хуже исходного, но среди миллионов клеток находятся и более продуктивные. Их отбирают, снова обрабатывают мутагеном и снова отбирают. Так, ступень за ступенью, выход пенициллина подняли с нескольких миллиграммов на литр у природного гриба до десятков граммов на литр у современных штаммов.

Для отбора применяют хитрые приёмы. Метод отпечатков (реплик) предложили Джошуа и Эстер Ледерберг в 1952 г. [7]: колонии с одной чашки переносят бархатной «печатью» сразу на несколько чашек с разными средами и сравнивают, где колония растёт, а где нет. Так находят, например, мутантов, утративших способность синтезировать определённую аминокислоту (ауксотрофов), — они растут на полной среде и не растут на минимальной.

Опыт Ледербергов дал и важный теоретический вывод: мутанты, устойчивые к фагу или антибиотику, существуют в культуре ещё до встречи с ним — отбор лишь выявляет их, а не создаёт мутации. Это прямое подтверждение того, что мутации случайны и не направлены на приспособление.

Генная инженерия и метаболическая инженерия

Сегодня, зная полный геном продуцента и пути его обмена, улучшают штамм прицельно: усиливают работу генов ферментов, ведущих к продукту, выключают гены побочных путей, снимают обратную связь — подавление синтеза конечным продуктом, — вводят гены из других организмов. Так создают, например, штаммы кишечной палочки и коринебактерий, выделяющие в среду более 100 г аминокислоты на литр.

Хранение штаммов

Ценный штамм нельзя просто пересевать годами: при каждом пересеве накапливаются мутации, и продуктивность падает. Поэтому штаммы хранят в «законсервированном» виде:

• лиофилизация — быстрое замораживание и высушивание под вакуумом; сухая культура в запаянной ампуле сохраняет жизнеспособность десятилетиями;
• глубокое замораживание при −80 °С или в жидком азоте (−196 °С) с защитными веществами (глицерином);
• для некоторых грибов — под слоем стерильного минерального масла.

Существуют национальные и международные коллекции микроорганизмов — «банки штаммов», откуда исследователи и предприятия получают проверенные культуры. В России одна из крупнейших — Всероссийская коллекция микроорганизмов в Пущине.

16. Бактерии, дрожжи, грибы, водоросли: сравнение

17. Как выбирают продуцента: четыре примера

Инсулин человека

Инсулин — небольшой белок из двух цепей, соединённых дисульфидными мостиками, без углеводов. Поэтому его можно получать в кишечной палочке: в неё вводят ген предшественника инсулина, а после выделения белок «доводят» ферментами в пробирке. Другой путь — дрожжи, которые сами выделяют предшественник в среду, что упрощает очистку. Оба способа используются в мире. Раньше инсулин выделяли из поджелудочных желёз коров и свиней; он немного отличался от человеческого и у части больных вызывал аллергию.

Моноклональное антитело

Антитело — крупный белок из четырёх цепей с присоединёнными углеводами, от которых зависит его работа в организме. Бактерии его правильно собрать не могут, поэтому продуцентом служат клетки млекопитающих (чаще всего клетки яичника китайского хомячка). Это уже не микроорганизм, а культура клеток — тема шестой статьи серии.

Лимонная кислота

Лимонную кислоту прежде выделяли из лимонов. Сегодня почти всю её получают с помощью аспергилла чёрного: гриб на сахаре или мелассе выделяет в среду до 70–80 % от массы сахара в виде лимонной кислоты. Это пример неполного окисления у гриба. Лимонная кислота — один из самых массовых продуктов биотехнологии: её производят миллионами тонн в год для напитков, кондитерских изделий, моющих средств.

Топливный этанол

Этанол лучше всего получают с помощью дрожжей: они устойчивы к высокой концентрации спирта (до 12–15 %), растут в кислой среде, где мешающие бактерии развиваются плохо, и безопасны. Бактерия Zymomonas, из которой в Мексике делают пульке, сбраживает глюкозу быстрее дрожжей и с большим выходом спирта, но использует меньше видов сахаров и хуже переносит промышленные условия, поэтому применяется гораздо реже.

18. Безопасность продуцентов

Микроорганизмы-продуценты делят по степени опасности. Самые безопасные — виды с долгой историей использования в пище: пекарские дрожжи, молочнокислые бактерии, аспергилл рисовый, сенная палочка. В США для них введён статус «в целом признано безопасным» (GRAS), в Европейском союзе — список организмов с «квалифицированной презумпцией безопасности» (QPS).

Даже безопасный продуцент проверяют: не образует ли он токсинов в промышленных условиях, не несёт ли генов устойчивости к антибиотикам, которые могли бы передаться другим бактериям, не попадают ли его клетки в готовый продукт. Например, некоторые плесневые грибы при определённых условиях образуют микотоксины, и производство лимонной кислоты контролируют, чтобы этого не происходило.

19. Микроорганизмы внутри нас: пробиотики

Отдельное направление — использование живых микроорганизмов для здоровья. Пробиотики — живые микроорганизмы, которые при приёме в достаточном количестве приносят пользу хозяину. Это в основном молочнокислые бактерии и бифидобактерии, а также некоторые дрожжи. Идея восходит к И. И. Мечникову, который в начале XX в. связывал долголетие болгарских крестьян с употреблением простокваши.

Современные исследования показали, что в кишечнике человека живут триллионы бактерий сотен видов — микробиота; их общая масса — около 0,2–0,3 кг. Они расщепляют неперевариваемые нами пищевые волокна, синтезируют витамины K и некоторые витамины группы B, тренируют иммунную систему, мешают заселению кишечника болезнетворными микробами. Эффективность конкретных пробиотиков сильно зависит от штамма и доказана не для всех; наиболее надёжно — при некоторых формах диареи, например вызванной приёмом антибиотиков.

Самый радикальный способ «биотехнологии микробиоты» — пересадка кишечной микробиоты от здорового донора; она высокоэффективна при тяжёлой повторной инфекции, вызванной бактерией Clostridioides difficile.

20. Микроорганизмы в экологической биотехнологии

Самые большие по объёму «биотехнологические заводы» — очистные сооружения. Через них ежедневно проходят миллионы кубометров сточных вод, и всю основную работу делают микроорганизмы.

Аэробная очистка: активный ил

В аэротенках — длинных бетонных бассейнах — сточную воду смешивают с активным илом и продувают воздухом. Активный ил — это хлопья, состоящие из бактерий, склеенных выделяемыми ими слизистыми веществами, с поселившимися среди них простейшими (инфузориями, амёбами, коловратками). Бактерии окисляют растворённые органические вещества до CO₂ и воды и используют их для роста; простейшие поедают свободноплавающие бактерии и осветляют воду. Затем ил осаждают в отстойниках, часть возвращают в аэротенк, а избыток направляют на переработку. Специальные группы бактерий удаляют из воды азот (нитрификация и денитрификация) и фосфор, чтобы сброс очищенной воды не вызывал «цветения» водоёмов.

Анаэробная переработка: биогаз

Осадок и избыток ила, навоз, пищевые отходы перерабатывают без доступа кислорода в метантенках. Это цепочка из нескольких групп микроорганизмов: одни расщепляют полимеры (белки, полисахариды, жиры) до мономеров, другие сбраживают их до органических кислот, спиртов, водорода и CO₂, третьи превращают кислоты в уксусную кислоту, и наконец метанообразующие археи образуют метан. Получается биогаз (обычно 55–70 % метана), который сжигают для получения тепла и электричества, а остаток — обеззараженное удобрение.

Очистка почв и вод от нефти

Многие бактерии (псевдомонады, родококки и др.) и грибы используют углеводороды нефти как источник углерода и энергии. На загрязнённые участки вносят культуры таких микроорганизмов с удобрениями (азотом и фосфором), рыхлят почву для доступа кислорода — и за месяцы содержание нефтепродуктов снижается в разы. Этот подход называют биоремедиацией.

Бактериальное выщелачивание металлов

Ацидитиобациллы — хемоавтотрофы — получают энергию, окисляя двухвалентное железо и сульфиды. При этом нерастворимые сульфиды металлов превращаются в растворимые сульфаты, а образующаяся серная кислота и ионы трёхвалентного железа растворяют руду ещё сильнее. Через отвалы бедной руды пропускают воду, бактерии работают внутри отвала, а из стекающего раствора извлекают медь. Значительная часть мировой меди получена именно так. Похожим способом «вскрывают» золотоносные руды, в которых мелкие частицы золота заключены в сульфидах.

21. Три знаменитых штамма

Кишечная палочка K-12

Штамм выделен в 1922 г. из кала выздоравливающего больного и десятилетиями хранился в коллекции Стэнфордского университета для учебных занятий. В 1940-х гг. на нём Ледерберг и Татум открыли конъюгацию бактерий — обмен генами. С тех пор K-12 стал главным модельным организмом: на его потомках изучены генетический код, регуляция генов (оперон), репликация ДНК; на них же выполнены первые опыты генной инженерии. Полный геном K-12 прочитан в 1997 г.

Пеницилл из Пеории

Гриб Флеминга давал всего несколько миллиграммов пенициллина на литр. В 1943 г. в лаборатории Министерства сельского хозяйства США в Пеории собирали плесени со всего света; лучший штамм нашли на заплесневевшей дыне с местного рынка. Его облучали рентгеновскими и ультрафиолетовыми лучами, обрабатывали химическими мутагенами и отбирали лучших мутантов. Современные промышленные штаммы — потомки той «дынной» плесени — дают десятки граммов пенициллина на литр. Прочтение их генома показало, что у них умножены копии генов синтеза пенициллина.

Коринебактерия из Токио

В 1956 г. японские микробиологи компании «Киова Хакко» под руководством Сигэдзо Киноситы обнаружили почвенную бактерию, выделяющую в среду глутаминовую кислоту. Её назвали Corynebacterium glutamicum. До этого глутамат натрия получали гидролизом белков пшеничной клейковины или сои. Открытие сделало аминокислоты массовым продуктом биотехнологии, а коринебактерия стала вторым после кишечной палочки «рабочим конём» промышленной микробиологии.

22. Словарь темы

• Продуцент — организм, образующий нужный продукт в промышленных условиях.
• Штамм — генетически однородная культура микроорганизма определённого вида с известными свойствами.
• Чистая культура — культура одного вида (штамма), потомство одной клетки.
• Колония — видимое скопление клеток на плотной среде, потомство одной клетки.
• Питательная среда — смесь веществ для выращивания микроорганизмов; элективная среда благоприятна только для определённой группы.
• Агар — полисахарид красных водорослей, придающий среде плотность.
• Стерилизация — уничтожение всех форм микроорганизмов, включая споры; асептика — приёмы, предотвращающие попадание посторонних микробов.
• Аэробы, анаэробы, факультативные анаэробы — организмы, нуждающиеся в кислороде, не переносящие его и способные жить в обоих условиях.
• Первичные метаболиты — вещества, необходимые для роста; вторичные — не нужные для роста (антибиотики, пигменты).
• Лаг-фаза, экспоненциальная, стационарная фаза, фаза отмирания — этапы роста периодической культуры.
• Экономический коэффициент — масса биомассы на единицу израсходованного субстрата.
• Плазмида — небольшая кольцевая ДНК бактерий, реплицирующаяся независимо от хромосомы; основа векторов генной инженерии.
• Лиофилизация — высушивание замороженной культуры под вакуумом для длительного хранения.

23. Итог: что важно знать

• Микроорганизмы — сборная группа: бактерии и археи (прокариоты), дрожжи и мицелиальные грибы, микроводоросли (эукариоты); вирусы используют как инструменты.
• Основные бактерии-продуценты: молочнокислые (кисломолочные продукты, квашение), уксуснокислые (уксус), кишечная палочка (рекомбинантные белки), бациллы (ферменты, биоинсектициды), коринебактерии (аминокислоты), стрептомицеты (антибиотики), клостридии (ацетон, бутанол).
• Дрожжи — факультативные анаэробы и эукариоты: хлеб, вино, пиво, спирт, кормовой белок, белки человека.
• Мицелиальные грибы — антибиотики (пенициллин), органические кислоты (лимонная), ферменты, сыры.
• Микроводоросли — фотоавтотрофы; дают белок, пигменты, витамины без органического субстрата.
• Продуценты почти всегда хемогетеротрофы-сапротрофы; по отношению к кислороду различают аэробов, анаэробов, факультативных анаэробов.
• Фазы роста периодической культуры: лаг-фаза, экспоненциальная (первичные метаболиты, биомасса), стационарная (вторичные метаболиты — антибиотики), отмирания.
• Чистую культуру получают рассевом на плотную среду с агаром: колония — потомство одной клетки; стерилизация в автоклаве уничтожает и споры.
• Промышленный штамм должен быть продуктивным, безопасным, генетически стабильным, расти на дешёвой среде; его получают скринингом, мутагенезом и отбором, генной инженерией и хранят лиофилизированным или замороженным.

24. Частые ошибки

• «Дрожжи — это бактерии». Дрожжи — одноклеточные грибы, эукариоты с ядром и митохондриями.
• «Все бактерии — вредные». Болезнетворных среди бактерий меньшинство; большинство безвредны, многие полезны и необходимы для круговорота веществ, пищевых производств, здоровья кишечника.
• «Брожение идёт с участием кислорода». Брожение — бескислородный процесс. Превращение спирта в уксус уксуснокислыми бактериями требует кислорода и потому является не брожением, а неполным окислением.
• «Антибиотики образуются в экспоненциальной фазе». Антибиотики — вторичные метаболиты, их синтез обычно усиливается при замедлении роста, в стационарной фазе.
• «Стрептомицин получают из плесневых грибов». Стрептомицин, тетрациклины, эритромицин образуют актиномицеты (стрептомицеты) — бактерии; из грибов получают пенициллин и цефалоспорины.
• «Спирулина — водоросль». По строению клетки спирулина — цианобактерия, прокариот; «сине-зелёными водорослями» цианобактерий называли по традиции.
• «Агар — питательное вещество для бактерий». Агар почти не разлагается большинством микроорганизмов; он нужен лишь для придания среде плотности.
• «Мутагенез создаёт нужные мутации». Мутагены лишь повышают частоту случайных мутаций; нужный мутант надо найти отбором среди огромного числа клеток.
• «Вирусы выращивают на питательной среде, как бактерии». Вирусы размножаются только в живых клетках — в культуре клеток, в куриных эмбрионах, в бактериях (фаги).
• «Кишечная палочка может производить любые белки человека». Белки, которым для работы нужны присоединённые углеводы и сложная сборка, в бактериях в активной форме не получаются.

25. Интересные факты

• Пекарские дрожжи — один из самых популярных модельных организмов: около трети их генов имеют близких родственников у человека, и многие открытия о клеточном цикле, старении, работе белков сделаны именно на дрожжах.
• Метод ПЦР придумал Кэри Маллис в 1983 г. Сначала в каждый цикл приходилось добавлять новый фермент, разрушавшийся при нагреве. Использование термостабильной полимеразы Thermus aquaticus сделало реакцию автоматической. Маллис получил Нобелевскую премию по химии в 1993 г.
• Бактерия Deinococcus radiodurans переносит дозу излучения в тысячи раз больше смертельной для человека: она быстро восстанавливает свою ДНК, разорванную на сотни кусков. Её изучают как возможного «уборщика» радиоактивных отходов.
• Аспергилл рисовый в Японии признан «национальным грибом»: без него не было бы соевого соуса, мисо и саке.
• Рекорд скорости деления среди известных бактерий принадлежит морской бактерии Vibrio natriegens: в оптимальных условиях она делится менее чем за 10 минут. Её предлагают как замену кишечной палочке в лабораториях.
• Синяя «глазурь» на некоторых сладостях и мороженом может быть окрашена фикоцианином из спирулины — природным синим пигментом.
• Крупнейшие коллекции микроорганизмов хранят десятки и сотни тысяч штаммов. Лиофилизированные культуры в запаянных ампулах остаются жизнеспособными десятилетиями без единого пересева.
• Геосмин, придающий запах сырой земле после дождя, выделяют стрептомицеты и цианобактерии; человек чувствует его в ничтожных концентрациях — в воде порядка нескольких нанограммов на литр.

26. Частые вопросы

Почему именно бактерии стали первыми объектами генной инженерии?

У них маленький кольцевой геном без интронов, есть плазмиды, которые легко выделить, изменить и ввести обратно; они гаплоидны, поэтому изменение гена сразу проявляется; они делятся за десятки минут, и за сутки из одной клетки получаются миллиарды копий введённого гена. Ни у одного многоклеточного организма такого сочетания свойств нет.

Чем дрожжи лучше бактерий для производства белков человека?

Дрожжи — эукариоты: у них есть ЭПС и комплекс Гольджи, поэтому они правильно сворачивают многие белки, образуют в них дисульфидные мостики, присоединяют углеводы и выводят белок в среду. Это облегчает очистку. Но углеводные цепи у дрожжей отличаются от человеческих, поэтому для самых сложных белков используют клетки млекопитающих.

Что такое факультативный анаэроб и почему это удобно?

Это организм, способный жить и с кислородом (тогда он дышит), и без него (тогда он бродит). Для технолога это означает выбор: одна и та же культура дрожжей при аэрации даёт много биомассы, а без доступа воздуха — спирт. Меняя условия, получают разные продукты.

Как в почве находят продуцентов антибиотиков?

Образец почвы разводят и рассевают на чашки; выросшие колонии выращивают рядом с тестовой бактерией (например, стафилококком). Если вокруг колонии образуется прозрачная зона, где тестовая бактерия не растёт, — колония выделяет вещество, подавляющее рост. Затем это вещество выделяют, проверяют его строение (не известно ли оно уже), токсичность и действие на заражённых животных.

Почему у промышленных штаммов со временем падает продуктивность?

Высокопродуктивный штамм тратит много ресурсов на образование продукта, который ему самому не нужен. Мутанты, утратившие эту «повинность», растут быстрее и постепенно вытесняют продуктивные клетки, особенно при многократных пересевах и в длительной непрерывной культуре. Поэтому штаммы хранят в замороженном или лиофилизированном виде и каждый производственный цикл начинают с исходной коллекционной культуры.

Чем стерилизация отличается от пастеризации?

Стерилизация уничтожает все микроорганизмы, включая споры (автоклав при 121 °С). Пастеризация — нагревание до 60–90 °С на короткое время — убивает большинство вегетативных клеток, включая болезнетворные, но не споры; она сохраняет вкус и витамины продукта лучше, чем стерилизация.

Зачем в биотехнологии водоросли, если бактерии растут быстрее?

Водорослям не нужен органический субстрат: они строят биомассу из углекислого газа, воды и солей за счёт света. Кроме того, они синтезируют вещества, которых нет у бактерий и дрожжей: каротиноиды, полиненасыщенные жирные кислоты, хлорофилл. Перспективно и их использование для улавливания CO₂ из промышленных газов.

Можно ли выращивать микроорганизм, который никогда не выращивали в лаборатории?

Большинство микроорганизмов из природных сред пока не удаётся вырастить на стандартных средах: им нужны соседи, особые вещества или условия. Но их гены можно прочитать прямо из образца почвы или воды (метагеномика) и перенести интересные гены — например, ферментов или путей синтеза антибиотиков — в удобный продуцент. Так открывают новые вещества, не выращивая их исходного «автора».

Что означает «КОЕ» на упаковке кефира или пробиотика?

КОЕ — колониеобразующие единицы, то есть число живых клеток, способных образовать колонию при посеве на питательную среду. Запись «не менее 10⁷ КОЕ/г» означает, что в грамме продукта к концу срока годности должно оставаться не менее 10 миллионов живых молочнокислых бактерий. Мёртвые клетки колоний не дают и в этот счёт не входят.

Чем прессованные дрожжи отличаются от сухих?

Прессованные дрожжи — живая биомасса, отделённая от среды и отжатая; в ней около 70 % воды, она хранится в холодильнике лишь несколько недель. Сухие дрожжи высушены мягко, до 5–8 % влаги: клетки переходят в состояние покоя и сохраняются месяцами при комнатной температуре, а в тёплой воде «оживают». Высушивание повреждает часть клеток, поэтому сухих дрожжей кладут в тесто меньше по массе, но каждый грамм их содержит больше клеток.

27. ЕГЭ

Тема относится к элементу 3.7 кодификатора [1]: «Объекты, используемые в биотехнологии, – клеточные и тканевые культуры, микроорганизмы, их характеристика», а также «Микробиологический синтез. Объекты микробиологических технологий». Кроме того, она опирается на материал о строении прокариотической и эукариотической клеток, об энергетическом обмене (дыхание и брожение) и о царствах Бактерии и Грибы.

Что обязательно знать

• Группы микроорганизмов-продуцентов и примеры продуктов, получаемых с их помощью.
• Различия прокариот и эукариот, важные для биотехнологии (плазмиды, отсутствие ядра и мембранных органоидов, обработка белков).
• Типы питания и отношение к кислороду; что такое факультативный анаэроб.
• Спиртовое и молочнокислое брожение: продукты, организмы, использование.
• Фазы роста культуры и что образуется в каждой.
• Требования к продуценту и способы получения штаммов.

Разбор типичных формулировок

«Установите соответствие между организмом и группой» (бактерии / грибы). Молочнокислые бактерии, кишечная палочка, стрептомицеты, клубеньковые бактерии, спирулина — бактерии; дрожжи, пеницилл, аспергилл — грибы. Ловушки: стрептомицеты («мицелий» в названии) и спирулина («водоросль»).

«Выберите признаки, характерные для дрожжей». Одноклеточные грибы; эукариоты; размножаются почкованием; факультативные анаэробы; при брожении образуют спирт и углекислый газ; используются в хлебопечении и виноделии. Неверно: «прокариоты», «автотрофы», «образуют молочную кислоту».

Часть 2: «Почему при производстве дрожжей для хлебопечения через среду продувают воздух, а при производстве вина — нет?» Элементы ответа: 1) дрожжи — факультативные анаэробы; 2) с кислородом они дышат, получают много энергии и быстро наращивают биомассу — нужную для хлебопечения; 3) без кислорода сбраживают сахар с образованием этанола — нужного в виноделии.

Часть 2: «Почему молочнокислые бактерии подавляют гнилостные?» Элементы: 1) образуют молочную кислоту; 2) кислота снижает pH; 3) гнилостные бактерии в кислой среде не размножаются; 4) молочнокислые бактерии сами кислотоустойчивы.

28. Для олимпиад

Подсчёт клеток: метод разведений

Сколько живых клеток в культуре, определяют посевом разведений. Культуру последовательно разводят в 10 раз (1 мл в 9 мл стерильной воды) и высевают по 0,1 мл каждого разведения на чашку. Подсчитывают чашку, на которой выросло 30–300 колоний. Каждая колония — от одной живой клетки (колониеобразующая единица, КОЕ).

Пример. На чашке с разведением 10⁻⁶, куда высеяли 0,1 мл, выросло 150 колоний. Концентрация: 150 / 0,1 мл · 10⁶ = 1,5 · 10⁹ КОЕ/мл. Подсчёт под микроскопом в счётной камере даёт число всех клеток, включая мёртвые, поэтому он обычно больше.

Скорость роста по двум точкам

Если за время t число клеток выросло от N₀ до N, число поколений n = log₂(N/N₀) = 3,32 · lg(N/N₀), а время поколения g = t / n.

Пример. За 4 часа число клеток выросло от 2 · 10⁴ до 1,3 · 10⁸ на миллилитр: отношение 6500, lg 6500 ≈ 3,81, n ≈ 12,7, g = 240 / 12,7 ≈ 19 мин. Это типично для кишечной палочки на богатой среде.

Сколько сахара нужно на биомассу

Экономический коэффициент дрожжей при аэробном росте на сахаре — около 0,5 г сухой биомассы на грамм сахара. Сухое вещество составляет около четверти массы прессованных дрожжей. Значит, для получения 1 т прессованных дрожжей нужно 0,25 т сухого вещества, то есть около 0,5 т сахара, а с учётом того, что меласса содержит около 50 % сахара, — около 1 т мелассы. Расчёт показывает, почему дрожжевые заводы строили рядом с сахарными.

Опыт Ледербергов: как отличить отбор от индукции

Классический вопрос: возникает ли устойчивость бактерий к фагу или антибиотику под действием этого фактора (индукция) или устойчивые мутанты уже есть в культуре и фактор лишь отбирает их? Опыт с отпечатками: культуру без антибиотика выращивают на чашке до сплошного роста, затем делают отпечатки на чашки с антибиотиком. Устойчивые колонии появляются в одних и тех же местах на разных отпечатках. Значит, устойчивые клетки были на исходной чашке до контакта с антибиотиком. Если взять клетки из этого места исходной чашки, которые антибиотика никогда не видели, — они окажутся устойчивыми. Мутации предшествуют отбору [7].

Ранее тот же вывод сделали С. Лурия и М. Дельбрюк (1943) статистически: число устойчивых мутантов в параллельных культурах сильно колебалось — в одних почти не было, в других было очень много («джекпоты»), что возможно, лишь если мутации возникали случайно в разное время роста культуры [8].

Почему лимонная кислота накапливается

Лимонная кислота — первый продукт цикла Кребса. Аспергилл выделяет её в больших количествах, когда работа цикла «за лимонной кислотой» замедлена, а поступление сахара велико. На это влияет состав среды: недостаток марганца и железа, избыток сахара, кислая среда (pH около 2), интенсивная аэрация. В кислой среде к тому же почти не растут бактерии-контаминанты. Это пример того, как изменение условий переводит обмен микроорганизма в режим «перепроизводства».

Регуляция синтеза и перепроизводство аминокислот

Нормальная клетка не тратит ресурсы зря: избыток конечного продукта (например, аминокислоты) подавляет активность первого фермента пути (ингибирование по типу обратной связи) и синтез ферментов пути. Чтобы клетка выделяла аминокислоту в среду, нужно эту регуляцию сломать. Например, мутант, устойчивый к аналогу лизина (веществу, похожему на лизин и обманывающему регуляторный фермент), часто имеет фермент, нечувствительный к лизину, — и накапливает лизин в огромных количествах. На этом основан отбор продуцентов аминокислот на средах с аналогами.

29. Задания с разбором

Задание 1

Какие из перечисленных организмов — прокариоты: дрожжи, кишечная палочка, пеницилл, стрептомицет, хлорелла, спирулина, молочнокислая бактерия?

Задание 2

Установите соответствие между продуктом и продуцентом: А) стрептомицин; Б) пенициллин; В) уксус; Г) лизин; Д) йогурт; Е) биоинсектицид против гусениц. Продуценты: 1) стрептомицет; 2) пеницилл; 3) уксуснокислые бактерии; 4) коринебактерия; 5) молочнокислые бактерии; 6) бацилла тюрингская.

Задание 3

Выберите три верных утверждения о дрожжах. 1) Дрожжи — прокариоты. 2) Дрожжи — факультативные анаэробы. 3) Дрожжи размножаются почкованием. 4) При брожении дрожжи образуют молочную кислоту. 5) Дрожжи способны присоединять углеводы к белкам. 6) Дрожжи — автотрофы.

Задание 4

Расположите фазы роста периодической культуры по порядку и укажите, в какой из них образуются антибиотики.

Задание 5

Почему в лаг-фазе число клеток почти не растёт, хотя клетки живы и активны?

Задание 6

Чем облигатный анаэроб отличается от факультативного? Приведите примеры.

Задание 7

Зачем в питательную среду добавляют агар? Почему именно агар, а не желатин?

Задание 8

Найдите ошибки и исправьте: 1) Уксуснокислые бактерии — анаэробы. 2) Стрептомицеты — плесневые грибы. 3) Кишечная палочка — продуцент инсулина человека. 4) Спирулина — цианобактерия. 5) Пастеризация уничтожает споры.

Задание 9

Почему белок человека, имеющий углеводные цепи, получают не в кишечной палочке, а в дрожжах или клетках млекопитающих?

Задание 10

Назовите не менее четырёх требований к промышленному продуценту.

Задание 11

Как получают чистую культуру микроорганизма? Почему колония считается потомством одной клетки?

Задание 12

Почему культуру для производства антибиотика не выгодно выращивать в хемостате при высокой скорости разбавления?

Задание 13

Объясните, почему молочнокислые бактерии консервируют продукты.

Задание 14

Чем отличаются стерилизация, пастеризация и дезинфекция?

Задание 15

Какие преимущества и недостатки у микроводорослей как объектов биотехнологии?

Задание 16

Почему промышленные штаммы хранят лиофилизированными или замороженными, а не пересевают постоянно?

Задание 17

Установите соответствие между типом питания и организмом: А) спирулина; Б) пекарские дрожжи; В) железобактерии; Г) пеницилл; Д) хлорелла. Типы: 1) фотоавтотроф; 2) хемоавтотроф; 3) хемогетеротроф.

Задание 18

Зачем при отборе продуцентов используют элективные среды? Приведите пример.

Задание 19 (олимпиадное)

Культуру развели последовательно в 10 раз шесть раз и высеяли 0,1 мл последнего разведения на чашку — выросло 84 колонии. Под микроскопом в той же культуре насчитали 1,2 · 10⁹ клеток/мл. Какая доля клеток живая? Через сколько поколений культура с такой плотностью живых клеток достигнет 10¹⁰ живых клеток/мл (если бы среда позволяла)?

Задание 20 (олимпиадное)

В опыте с отпечатками бактерии выращивали на чашке без стрептомицина, затем сделали отпечатки на три чашки со стрептомицином. На всех трёх устойчивые колонии выросли в одних и тех же местах. Какой вывод можно сделать? Как доказать его ещё строже, не подвергая клетки действию антибиотика?

Литература

1. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.
2. Brock T. D., Freeze H. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile // Journal of Bacteriology. 1969. Vol. 98, № 1. P. 289–297. DOI: 10.1128/jb.98.1.289-297.1969.
3. Chien A., Edgar D. B., Trela J. M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus // Journal of Bacteriology. 1976. Vol. 127, № 3. P. 1550–1557. DOI: 10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976.
4. Ahmad M., Hirz M., Pichler H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production // Applied Microbiology and Biotechnology. 2014. Vol. 98, № 12. P. 5301–5317. DOI: 10.1007/s00253-014-5732-5.
5. Becker E. W. Micro-algae as a source of protein // Biotechnology Advances. 2007. Vol. 25, № 2. P. 207–210. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2006.11.002.
6. Monod J. The growth of bacterial cultures // Annual Review of Microbiology. 1949. Vol. 3. P. 371–394. DOI: 10.1146/annurev.mi.03.100149.002103.
7. Lederberg J., Lederberg E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants // Journal of Bacteriology. 1952. Vol. 63, № 3. P. 399–406. DOI: 10.1128/jb.63.3.399-406.1952.
8. Luria S. E., Delbrück M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance // Genetics. 1943. Vol. 28, № 6. P. 491–511. DOI: 10.1093/genetics/28.6.491.