Культуры клеток животных и человека

Вакцины против полиомиелита, кори и гриппа, моноклональные антитела против опухолей, искусственная кожа для ожоговых больных, проверка лекарств без опытов на животных — всё это работа клеток животных и человека, растущих в пластиковых флаконах и ферментёрах. У этих культур свои законы: клетки требуют сыворотки, прикрепления к поверхности, делятся ограниченное число раз и не способны дать целый организм. Разберём, как они устроены и что с их помощью получают. Это шестая статья серии «Биотехнология».

• 1. Что такое культура клеток животных
• 2. Как выращивают клетки животных
• 3. Предел Хейфлика: почему нормальные клетки стареют
• 4. HeLa и история клеточных линий
• 5. Какие линии используют в промышленности
• 6. Производство вакцин
• 7. Гибридомы и моноклональные антитела
• 8. Производство белков-лекарств
• 9. Клетки в медицине
• 10. Органоиды и ткани в пробирке
• 11. Культуры клеток вместо опытов на животных
• 12. Клетки растений и животных в культуре: ещё раз о различиях
• 13. История культуры клеток животных
• 14. Стволовые клетки в культуре
• 15. Культуры клеток в животноводстве и ветеринарии
• 16. Словарь темы
• 17. Как выглядит лаборатория клеточных культур
• 18. Как следят за состоянием культуры
• 19. Биореакторы для клеток животных
• 20. Вирусы и клеточные культуры
• 21. Бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих: как выбирают
• 22. Этические и правовые рамки
• 23. Что впереди
• 24. Клетки в диагностике
• 25. Почему это важно знать
• 26. Чем клетка в культуре отличается от клетки в организме
• 27. Что из этого спрашивают в школьном курсе
• 28. Как культура клеток изменила борьбу с полиомиелитом
• 29. Небольшие, но важные детали
• 30. Трудности работы с животными клетками
• 31. Культивируемое мясо
• 32. Итог: что важно знать
• 33. Частые ошибки
• 34. Интересные факты
• 35. Частые вопросы
• 36. ЕГЭ
• 37. Для олимпиад
• 38. Задания с разбором
• Литература

1. Что такое культура клеток животных

Культура клеток животных — выращивание клеток, выделенных из организма животного или человека, на искусственной питательной среде вне организма. Кодификатор относит «клеточные и тканевые культуры» к главным объектам биотехнологии [1].

В отличие от растительных культур, здесь почти никогда не ставится задача вырастить организм: специализированные клетки животных утратили тотипотентность. Культуры животных клеток служат другим целям:

• производство вакцин, белков-лекарств, антител;
• исследование клеточных процессов, болезней, действия веществ;
• испытание лекарств и оценка токсичности — вместо опытов на животных;
• медицина: выращивание кожи и хрящей для пересадки, клеточная терапия, вспомогательные репродуктивные технологии.

Типы культур

2. Как выращивают клетки животных

Получение первичной культуры

Кусочек ткани (кожи, почки, печени, зародыша) измельчают и обрабатывают ферментом трипсином или коллагеназой, который разрушает межклеточное вещество и связи между клетками. Полученную суспензию клеток помещают в сосуд с питательной средой. Клетки оседают, прикрепляются к поверхности и начинают делиться, образуя слой.

Среда

Среда для животных клеток сложнее растительной: она должна воспроизводить состав межклеточной жидкости.

• Соли в концентрациях, близких к плазме крови, — изотонический раствор;
• Глюкоза — источник энергии;
• Аминокислоты, в том числе незаменимые, — клетки не умеют их синтезировать;
• Витамины;
• Буфер (гидрокарбонат с углекислым газом инкубатора или органический буфер) — клетки очень чувствительны к pH; поэтому инкубаторы поддерживают 5 % CO₂;
• Индикатор pH (феноловый красный) — по цвету среды видно состояние культуры: от красного (норма) к жёлтому (закисление) или малиновому (защелачивание);
• Сыворотка крови (обычно телячья эмбриональная, 5–10 %) — источник факторов роста, гормонов, белков-переносчиков, веществ, помогающих прикреплению;
• Антибиотики — для защиты от бактерий (хотя основной способ — строгая стерильность).

Условия

Температура 37 °С (для клеток млекопитающих), влажная атмосфера с 5 % CO₂, стерильность. Работают в ламинарном боксе; среду меняют каждые 2–3 дня, потому что клетки расходуют глюкозу и выделяют молочную кислоту.

Прикрепление и пересев

Большинство клеток животных прикрепляются к поверхности и делятся, пока не покроют её сплошным слоем. Дальше срабатывает контактное торможение: клетки, окружённые соседями, перестают делиться. Чтобы культура росла дальше, её пересевают: обрабатывают трипсином, снимают с поверхности, разбавляют и рассаживают в несколько сосудов. Опухолевые клетки контактного торможения не знают — они продолжают делиться и нарастают в несколько слоёв.

Клетки крови и некоторые линии растут в суспензии, не прикрепляясь; именно их удобно выращивать в ферментёрах. Прикрепляющиеся клетки для промышленного выращивания сажают на микроносители — мельчайшие шарики, взвешенные в среде: так в одном аппарате помещается огромная поверхность.

3. Предел Хейфлика: почему нормальные клетки стареют

До середины XX в. считалось, что клетки в культуре могут делиться вечно, а гибель культуры — следствие плохих условий. В 1961 г. Леонард Хейфлик и Пол Мурхед показали обратное: нормальные клетки человека (фибробласты) делятся в культуре ограниченное число раз — примерно 40–60, — после чего перестают делиться, хотя остаются живыми [2]. Это число назвали пределом Хейфлика.

Причина выяснилась позже: при каждой репликации ДНК концы линейных хромосом — теломеры — немного укорачиваются, потому что ДНК-полимераза не может достроить самый конец отстающей цепи. Когда теломеры укорачиваются до критической длины, клетка воспринимает это как повреждение ДНК и переходит в состояние репликативного старения: деление прекращается необратимо.

У половых и стволовых клеток работает фермент теломераза, достраивающий теломеры, — они делятся намного дольше. У большинства опухолевых клеток теломераза тоже включена: это одна из причин их «бессмертия» в культуре.

Три вида клеточных культур по продолжительности жизни

Для производства лекарств «бессмертные» линии удобнее: их можно размножать без ограничений. Но для изучения нормальных процессов и для некоторых вакцин нужны клетки с нормальным набором хромосом.

4. HeLa и история клеточных линий

Самая известная клеточная линия — HeLa. Её получили в 1951 г. в лаборатории Джорджа Гая из опухоли шейки матки пациентки Генриетты Лакс, умершей в том же году. Прежде клетки человека в культуре быстро погибали; эти же делились безостановочно. Линия стала первой постоянной линией клеток человека и разошлась по лабораториям всего мира.

На HeLa:

• впервые размножили вирус полиомиелита в культуре клеток, что позволило испытать и наладить производство вакцины [3];
• изучали деление клетки, действие лекарств и излучения, строение хромосом;
• отрабатывали методы клонирования клеток, слияния клеток, культивирования в невесомости.

История HeLa поставила и этические вопросы: клетки были взяты без ведома и согласия пациентки и её семьи, тогда это не требовалось правилами. Спустя десятилетия семья Лакс добилась участия в решениях об использовании данных генома линии. Сегодня работа с материалом человека требует информированного согласия донора и соблюдения правил защиты персональных данных.

Проблема перекрёстного загрязнения

HeLa оказались необычайно живучи: попадая в другие культуры, они вытесняли их клетки. В 1960–1970-х гг. выяснилось, что множество «новых линий» в лабораториях мира на самом деле — HeLa. Это испортило результаты сотен работ. Поэтому сегодня линии обязательно проверяют на подлинность — сравнивают набор коротких повторов ДНК с эталонным, как в криминалистике.

5. Какие линии используют в промышленности

По данным обзоров рынка биофармацевтики, большинство белковых лекарств, выпускаемых сегодня, производится именно в клетках млекопитающих, прежде всего CHO [4]. Причина — в правильной обработке белка после синтеза, о которой говорилось в первой статье серии.

6. Производство вакцин

Культуры клеток произвели переворот в вакцинологии. До 1949 г. вирусы умели размножать только в живом организме или в курином эмбрионе. Джон Эндерс, Томас Уэллер и Фредерик Роббинс показали, что вирус полиомиелита размножается в культуре клеток человека — и получили за это Нобелевскую премию 1954 г. Это открыло путь к массовому производству вакцин: в культуре клеток можно нарастить огромное количество вируса в контролируемых условиях.

Как делают вакцины на клеточных культурах

1. Клетки (Vero, MDCK, диплоидные фибробласты) выращивают в биореакторах, часто на микроносителях.
2. В культуру вносят вирус; он размножается в клетках, разрушая их.
3. Культуральную жидкость собирают, вирус очищают.
4. Далее — в зависимости от типа вакцины: вирус инактивируют (убивают формальдегидом или другим способом), либо используют ослабленный (аттенуированный) штамм, либо выделяют отдельные белки вируса.
5. Препарат стандартизуют, добавляют стабилизаторы и при необходимости адъювант, разливают и проверяют.

Типы вакцин и роль культур

Куриные эмбрионы до сих пор используют для производства большей части вакцин против гриппа, но клеточные культуры постепенно вытесняют их: они не зависят от поставок яиц, подходят людям с аллергией на белок куриного яйца и позволяют быстрее нарастить выпуск при эпидемии.

7. Гибридомы и моноклональные антитела

Задача

Антитела — белки иммунной системы, узнающие определённый участок (эпитоп) чужеродной молекулы. При иммунизации животного в его крови появляется смесь антител от множества разных клонов лимфоцитов — поликлональные антитела. Они узнают разные участки антигена, их состав меняется от животного к животному и от сыворотки к сыворотке.

Для диагностики и лечения нужны моноклональные антитела — абсолютно одинаковые молекулы, узнающие один эпитоп. Их источником должен быть один клон лимфоцитов. Но лимфоцит, выделенный из организма, в культуре почти не делится и быстро погибает.

Решение: гибридома

В 1975 г. Жорж Кёлер и Сезар Мильштейн соединили два свойства в одной клетке [5]:

1. Мышь иммунизируют нужным антигеном; через некоторое время из её селезёнки выделяют B-лимфоциты, среди которых есть клетки, производящие нужное антитело.
2. Берут клетки миеломы — опухоли из клеток того же ряда, которые делятся в культуре неограниченно.
3. Клетки сливают (полиэтиленгликолем или электрическим импульсом). Получаются гибридомы — клетки, унаследовавшие от лимфоцита способность производить определённое антитело, а от миеломной клетки — способность бесконечно делиться.
4. Смесь высевают на селективную среду, на которой несслившиеся миеломные клетки погибают (у них выключен запасной путь синтеза нуклеотидов), а несслившиеся лимфоциты сами по себе не делятся. Выживают только гибридомы.
5. Гибридомы рассаживают поодиночке, выращивают клоны и проверяют, какое антитело производит каждый. Нужный клон размножают и хранят замороженным.

За эту работу Кёлер и Мильштейн получили Нобелевскую премию 1984 г. (вместе с Нильсом Ерне).

Где применяют моноклональные антитела

• Диагностика: тест-полоски (например, на беременность — они узнают гормон ХГЧ; экспресс-тесты на инфекции), иммуноферментный анализ, определение групп крови, выявление белков в тканях.
• Лечение: противоопухолевые препараты, узнающие белки на поверхности опухолевых клеток; лекарства против аутоиммунных болезней, подавляющие определённые сигнальные молекулы; препараты против астмы, мигрени, высокого холестерина; средства против инфекций.
• Очистка веществ: антитело, закреплённое на носителе, вылавливает из смеси одно вещество.
• Исследования: мечение белков в клетке, разделение клеток по поверхностным маркёрам.

Мышиные антитела в организме человека вызывают иммунный ответ, поэтому современные препараты делают химерными, гуманизированными или полностью человеческими: методами генной инженерии мышиные участки заменяют человеческими, оставляя лишь узнающие фрагменты, либо получают антитела от мышей с человеческими генами антител, либо отбирают нужные антитела из огромных библиотек вариантов. Производят их уже не в гибридомах, а в клетках CHO.

8. Производство белков-лекарств

Многие лекарства — это белки человека: гормоны, ферменты, факторы свёртывания крови, антитела. Простые из них (инсулин, гормон роста) получают в бактериях и дрожжах. Сложные — в клетках млекопитающих.

Почему именно клетки млекопитающих

• Гликозилирование. К белку присоединяются углеводные цепи, от которых зависят его устойчивость в крови, работа и способность не вызывать иммунного ответа. У бактерий этого нет вовсе, у дрожжей цепи другие.
• Правильная укладка и сборка. Антитело состоит из четырёх цепей, соединённых дисульфидными мостиками; собрать их правильно умеют только эукариотические клетки с развитой ЭПС.
• Дальнейшая обработка. Отрезание сигнальных участков, присоединение фосфатных групп, созревание белка.

Как устроено производство

1. Создание линии-продуцента. В клетки CHO вводят ген нужного белка вместе с регуляторными участками и маркёром; отбирают клетки, встроившие ген в удачное место и производящие много белка; из одной такой клетки выращивают клон.
2. Банк клеток. Клон замораживают в жидком азоте — создают главный и рабочий банки; каждый производственный цикл начинается с ампулы из рабочего банка.
3. Наращивание. Флакон → качалочные колбы → биореакторы возрастающего объёма (50 л → 500 л → 2000 л и более).
4. Производственная ферментация. 10–14 суток с подпиткой; клетки выделяют белок в среду; поддерживают температуру 37 °С, pH, содержание кислорода, осмолярность.
5. Выделение и очистка. Клетки отделяют; белок очищают хроматографией (для антител — на колонке с белком A, который избирательно связывает антитела), удаляют возможные вирусы фильтрацией и обработкой, концентрируют.
6. Контроль. Чистота, структура углеводных цепей, активность, отсутствие посторонних агентов — десятки показателей.

Производительность таких процессов за тридцать лет выросла примерно в сто раз: если в 1980-х получали десятки миллиграммов антител на литр, то сегодня — несколько граммов на литр. Рост достигнут отбором линий, составом сред без сыворотки и режимом подпитки.

Отказ от сыворотки

Телячья эмбриональная сыворотка — дорогой и непостоянный по составу компонент, к тому же источник возможного заражения вирусами и прионами. Поэтому промышленность перешла на бессывороточные и даже полностью химически определённые среды, где все компоненты известны: рекомбинантный инсулин, трансферрин, факторы роста, липиды. Это повышает воспроизводимость и безопасность.

9. Клетки в медицине

Выращивание кожи

При обширных ожогах собственной кожи для пересадки не хватает. Из небольшого кусочка здоровой кожи больного выделяют кератиноциты и размножают их в культуре; за 3–4 недели из участка размером с почтовую марку получают пласты, которыми можно закрыть значительную поверхность тела. Пересаженная собственная кожа не отторгается. Применяют и временные покрытия из донорских или искусственных материалов с клетками, чтобы защитить рану, пока растёт собственная.

Хрящ, кость, роговица

• Хрящ: у пациента берут небольшой фрагмент хряща, размножают хондроциты в культуре и вводят их в повреждённый сустав.
• Роговица: при повреждении лимбальных стволовых клеток глаза их размножают в культуре и пересаживают, восстанавливая прозрачность роговицы.
• Кость и сосуды: клетки выращивают на пористых каркасах, которые постепенно рассасываются, оставляя ткань.

Клеточная терапия

Самый старый и надёжный её пример — пересадка костного мозга (точнее, кроветворных стволовых клеток) при лейкозах и некоторых наследственных болезнях. Новое направление — CAR-T-терапия: у пациента берут T-лимфоциты, вводят в них ген искусственного рецептора, узнающего белок опухолевых клеток, размножают эти клетки в культуре и возвращают больному. Такие препараты применяются при некоторых опухолях крови.

Вспомогательные репродуктивные технологии

При ЭКО яйцеклетки и зародыши несколько суток развиваются в культуре в специальных средах и инкубаторах. Об этом — в следующей статье серии.

10. Органоиды и ткани в пробирке

Клетки, растущие одним слоем на пластике, мало похожи на ткань организма. Поэтому всё больше работ ведут в трёхмерных культурах.

• Сфероиды — шаровидные скопления клеток; в них, как в настоящей опухоли, есть наружный слой делящихся клеток и внутренняя зона с недостатком кислорода. На сфероидах точнее испытывают противоопухолевые препараты.
• Органоиды — структуры, которые стволовые клетки сами формируют в трёхмерном геле, воспроизводя строение органа в миниатюре. Первыми получили органоиды кишечника из стволовых клеток крипт [6]; затем — органоиды желудка, печени, почки, лёгкого, мозга [7].
• «Орган-на-чипе» — микроустройство с каналами, по которым течёт среда, и клетками разных типов: воспроизводит и строение, и механику (например, растяжение лёгочной ткани при дыхании).
• Биопечать — послойное нанесение клеток в геле по заданной трёхмерной модели.

Что это даёт: модели болезней на клетках конкретного пациента, испытание лекарств без опытов на животных, изучение развития органов. Чего пока не даёт: полноценных органов для пересадки. Органоид не имеет собственных сосудов, поэтому его размер ограничен несколькими миллиметрами — глубже клетки не получают кислорода.

11. Культуры клеток вместо опытов на животных

Проверка безопасности лекарств, косметики, пищевых добавок традиционно требовала опытов на животных. Культуры клеток позволяют заменить часть этих опытов.

• Оценка токсичности: клетки обрабатывают веществом в разных концентрациях и определяют, при какой из них гибнет половина клеток.
• Раздражающее действие: модели кожи и роговицы из выращенных клеток заменили прежние опыты на глазах кроликов; такие модели официально приняты в Европейском союзе.
• Влияние на печень: культуры клеток печени показывают, как лекарство превращается в организме и не образуются ли ядовитые продукты.
• Генетическая безопасность: проверка, не вызывает ли вещество повреждений хромосом.
• Контроль партий лекарств: вместо прежних проб на животных применяют клеточные тесты на присутствие опасных примесей.

Принцип «трёх R» — replacement, reduction, refinement (замена, сокращение, усовершенствование) — требует по возможности заменять животных другими моделями, уменьшать их число и снижать страдания. Полностью отказаться от опытов на животных пока нельзя: культура клеток не воспроизводит работу целого организма — кровообращение, иммунитет, нервную регуляцию, взаимодействие органов. Но доля замещённых испытаний растёт.

12. Клетки растений и животных в культуре: ещё раз о различиях

13. История культуры клеток животных

• 1885 — Вильгельм Ру поддерживает живым кусочек нервной пластинки куриного зародыша в тёплом солевом растворе.
• 1907 — Росс Гаррисон выращивает нервные волокна из ткани лягушки в капле лимфы, наблюдая рост аксона; это считают рождением метода.
• 1910-е — Алексис Каррель вводит строгую асептику и длительное культивирование; его знаменитая культура клеток сердца курицы поддерживалась десятилетиями, что породило миф о «бессмертии» нормальных клеток (вероятно, в культуру регулярно попадали свежие клетки с экстрактом зародыша).
• 1940-е — появляются антибиотики, облегчившие стерильную работу; разрабатываются первые синтетические среды.
• 1949 — Эндерс, Уэллер и Роббинс размножают вирус полиомиелита в культуре клеток.
• 1951 — получена линия HeLa.
• 1955 — Гарри Игл публикует состав среды, ставшей основой современных сред.
• 1961 — Хейфлик и Мурхед открывают предел числа делений нормальных клеток [2].
• 1975 — Кёлер и Мильштейн создают гибридомы [5].
• 1980-е — промышленное производство белков в клетках CHO; первые препараты на основе моноклональных антител.
• 1998 — получены эмбриональные стволовые клетки человека.
• 2006 — получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.
• 2009–2014 — органоиды кишечника и других органов [6], [7].
• 2010-е — наши дни — CAR-T-терапия, «орган-на-чипе», культивируемое мясо, бессывороточные среды.

14. Стволовые клетки в культуре

Стволовая клетка — клетка, способная и делиться, сохраняя себя, и давать начало специализированным клеткам. Именно они делают возможной клеточную терапию и выращивание тканей. Подробно о них рассказано в отдельной статье блога; здесь — то, что относится к культуре клеток.

Перепрограммирование

В 2006 г. Синъя Яманака показал, что введение в клетку кожи всего четырёх генов-регуляторов возвращает её в плюрипотентное состояние. Это разрушило представление о необратимости специализации: оказалось, что «закрытые» программы развития можно открыть заново. За эту работу Яманака получил Нобелевскую премию 2012 г. вместе с Джоном Гёрдоном, который ещё в 1960-х гг. доказал то же самое пересадкой ядер у лягушек.

Практический смысл iPS-клеток: из клеток кожи больного можно получить плюрипотентные клетки, а из них — нейроны, клетки сердца или печени с его собственным генотипом. Такие клетки используют, чтобы изучать наследственные болезни «в пробирке» и подбирать лекарства, а в перспективе — для пересадки без отторжения.

Направленная дифференцировка

Чтобы превратить плюрипотентные клетки в нужный тип, им последовательно дают те же сигналы, которые действуют в зародыше: определённые факторы роста и их ингибиторы в строгом порядке и в строгие сроки. Так получают клетки сердечной мышцы (они даже сокращаются в чашке), нейроны, клетки сетчатки, клетки, вырабатывающие инсулин. Это долгие протоколы — от двух недель до нескольких месяцев.

15. Культуры клеток в животноводстве и ветеринарии

• Вакцины для животных — против ящура, бешенства, чумы плотоядных и многих других болезней — производят в культурах клеток.
• Диагностика: выделение вирусов из материала больных животных проводят, заражая культуры клеток.
• Эмбриональные технологии: оплодотворение яйцеклеток вне организма и выращивание зародышей до стадии пересадки — это тоже культура клеток, со своими средами и инкубаторами.
• Клонирование: клетки взрослого животного размножают в культуре, а затем их ядра переносят в яйцеклетки; культура позволяет сначала изменить гены этих клеток и отобрать нужные — так получают трансгенных и отредактированных животных.
• Культивируемое мясо — новое направление, о котором сказано выше.

Отдельная область — клеточные линии рыб и насекомых: их выращивают при более низкой температуре (15–28 °С) и используют для вакцин в аквакультуре и для производства белков.

16. Словарь темы

• Первичная культура — клетки, только что выделенные из ткани.
• Клеточная линия — культура, приспособившаяся к длительному росту; диплоидный штамм имеет нормальный кариотип, постоянная линия делится неограниченно.
• Пассаж (пересев) — перенос части клеток в новые сосуды со свежей средой.
• Контактное торможение — остановка деления при образовании сплошного слоя.
• Предел Хейфлика — максимальное число делений нормальной клетки.
• Теломеры и теломераза — концевые участки хромосом и фермент, их достраивающий.
• Микроноситель — мельчайший шарик, на котором растут прикрепляющиеся клетки в биореакторе.
• Гибридома — клетка от слияния лимфоцита и миеломной клетки, производящая моноклональные антитела.
• Моноклональные антитела — одинаковые антитела, полученные от одного клона клеток.
• Органоид — трёхмерная миниатюрная модель органа из стволовых клеток.
• Бессывороточная среда — среда без сыворотки крови, с известным набором компонентов.
• Криоконсервация — хранение клеток в жидком азоте с защитным веществом.

17. Как выглядит лаборатория клеточных культур

Помещение для работы с животными клетками устроено иначе, чем микробиологическая лаборатория: здесь главный враг — не только бактерии, но и любая другая клеточная линия.

• Ламинарный шкаф второго класса — рабочее место. Поток стерильного воздуха защищает и культуру от человека, и человека от аэрозоля из культуры.
• CO₂-инкубатор — шкаф с подогревом до 37 °С, подачей углекислого газа и поддоном с водой для влажности.
• Инвертированный микроскоп — объектив расположен снизу, что позволяет смотреть на клетки прямо через дно флакона, не вскрывая его.
• Центрифуга — для осаждения клеток при пересеве и отмывке.
• Сосуд Дьюара с жидким азотом — банк замороженных клеток.
• Водяная баня — для согревания сред до 37 °С, иначе холодная среда вызовет у клеток стресс.
• Одноразовый пластик — флаконы, чашки, пипетки, пробирки. Стеклянную посуду почти не используют: её трудно отмыть от следов веществ, губительных для клеток.

Правила работы жёсткие: одна линия клеток — один набор сред и пипеток; разные линии не вскрывают одновременно; новые линии держат в карантине и проверяют на микоплазму; всё, что касалось культуры, обеззараживают перед выбросом.

18. Как следят за состоянием культуры

Простое правило «смотреть на клетки каждый день» — основа работы: по виду культуры опытный исследователь замечает неладное раньше любого прибора.

19. Биореакторы для клеток животных

Промышленное выращивание животных клеток требует аппаратов, непохожих на микробные ферментёры: клетки крупнее, без стенки, чувствительны к сдвиговым усилиям и пузырькам воздуха.

• Перемешивание — медленное, лопастями особой формы.
• Аэрация — через мембрану или очень мелкими пузырьками; в среду добавляют вещества, защищающие клетки от повреждения пузырьками.
• Одноразовые биореакторы — стерильные мешки из полимера в опорной раме, часто с качающейся платформой вместо мешалки. Их не нужно мыть и стерилизовать, исключается перенос между продуктами; сегодня это основной формат для многих производств.
• Режимы: периодический с подпиткой (основной для производства белков, 10–14 суток) и перфузионный, при котором среда непрерывно обновляется, а клетки удерживаются фильтром, — он даёт высокую плотность клеток.
• Контроль: температура, pH, растворённый кислород, содержание глюкозы и лактата, плотность клеток; современные системы ведут процесс автоматически по заданной программе.

Промышленные биореакторы для клеток млекопитающих достигают объёма 2–20 тыс. литров — меньше, чем микробные (до сотен кубометров), потому что плотность клеток и концентрация продукта здесь ниже, а стоимость продукта на несколько порядков выше.

20. Вирусы и клеточные культуры

Культура клеток — главный инструмент вирусологии: вирусы размножаются только внутри живых клеток.

Как выращивают вирус

В культуру вносят материал, содержащий вирус, и наблюдают. Многие вирусы вызывают цитопатическое действие: клетки округляются, сливаются в многоядерные структуры, отслаиваются от поверхности, в них появляются включения. По характеру этих изменений вирусолог может предположить, какой вирус перед ним.

Количество вируса измеряют методом бляшек: разведённый материал наносят на сплошной слой клеток и покрывают его полужидкой средой, чтобы вирус не расплывался. Каждая вирусная частица заражает одну клетку, потомство заражает соседей, и через несколько дней на слое клеток видны круглые «дырки» — бляшки. Число бляшек, умноженное на разведение, даёт число инфекционных частиц.

Зачем это нужно

• Диагностика: выделение вируса из материала больного (сегодня чаще заменяется ПЦР, но для некоторых задач культура незаменима).
• Производство вакцин и получение вирусных векторов для генной терапии.
• Испытание противовирусных препаратов: сравнивают, насколько вещество снижает число бляшек.
• Изучение самих вирусов: как они проникают в клетку, размножаются, уходят от иммунитета.
• Получение ослабленных штаммов для живых вакцин: вирус долго выращивают в культуре клеток другого вида, где он приспосабливается к новому хозяину и теряет способность вызывать болезнь у человека. Так были получены вакцинные штаммы кори и полиомиелита.

Обратная сторона

Вирусы — ещё и угроза производству: клеточная линия или сыворотка могут содержать скрытый вирус, который попадёт в препарат. Поэтому технологические схемы обязательно включают стадии инактивации и удаления вирусов (обработка низким pH или детергентом, фильтрация через мембраны с очень мелкими порами), а банки клеток тщательно проверяют.

21. Бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих: как выбирают

Правило выбора простое: берут самую простую систему, которая справится с задачей. Если белок несложный — бактерии; если нужна секреция и умеренная обработка — дрожжи; если белок требует человеческих углеводных цепей и сложной сборки — клетки млекопитающих.

22. Этические и правовые рамки

Работа с клетками человека затрагивает интересы живых людей, поэтому она регулируется строже, чем работа с микроорганизмами.

• Информированное согласие. Донор должен понимать, что будет с его клетками, и дать письменное согласие. История HeLa — пример того, как это делалось раньше и почему правила изменились.
• Защита персональных данных. Геном клеточной линии — это геном конкретного человека и его родственников; данные обезличивают, а доступ к полным геномным данным ограничивают.
• Эмбриональные стволовые клетки. Их получение связано с разрушением бластоцисты, поэтому в разных странах действуют разные ограничения — от полного запрета до разрешённой работы с «лишними» зародышами, оставшимися после ЭКО, с согласия родителей. Появление iPS-клеток во многом сняло остроту этого спора.
• Запрет на создание организма. Репродуктивное клонирование человека запрещено законодательством многих стран, в том числе России; не допускается и изменение генома зародышей, предназначенных для беременности.
• Коммерческое использование. Вопросы о том, кому принадлежат клетки и доходы от лекарств, созданных на их основе, решались судами и привели к нынешним правилам информирования доноров.
• Безопасность работников. Клетки человека могут нести вирусы, поэтому с ними работают как с потенциально инфекционным материалом.

Общий принцип: биотехнология не решает сама, что допустимо. Границы задают закон, этические комитеты и общественное обсуждение, а учёные обязаны эти границы соблюдать и объяснять обществу суть своей работы.

23. Что впереди

• Персональные модели болезней. Из клеток пациента получают iPS-клетки, а из них — нейроны, кардиомиоциты, органоиды; на них подбирают лечение для конкретного человека.
• Клеточная терапия нового поколения. Усовершенствованные CAR-T-клетки, в том числе «универсальные», от донора; клетки, вырабатывающие инсулин, для лечения диабета; клетки сетчатки для лечения потери зрения.
• Органы на чипе и системы «человек на чипе» — связанные между собой модули с клетками разных органов; цель — предсказывать действие лекарства на организм без опытов на животных.
• Васкуляризация тканей. Главная нерешённая задача тканевой инженерии — создание сосудистой сети внутри выращиваемой ткани.
• Культивируемое мясо и молочные белки как часть пищевой промышленности.
• Удешевление сред за счёт рекомбинантных факторов роста, производимых микроорганизмами, и повторного использования среды в перфузионных системах.

Любопытно, что все эти направления сходятся на одном: мы учимся воспроизводить вне организма не отдельную клетку, а её окружение — соседей, межклеточное вещество, потоки жидкости, механические силы. Чем точнее воспроизведено окружение, тем ближе поведение клеток к тому, что происходит в живом организме.

24. Клетки в диагностике

Культуры клеток и полученные с их помощью антитела лежат в основе многих анализов, с которыми человек сталкивается в поликлинике.

Обратите внимание: почти во всех этих методах «рабочей частью» служат моноклональные антитела, полученные от гибридом или от клеток CHO. Биотехнология здесь прямо входит в повседневную медицину.

25. Почему это важно знать

Культуры клеток животных и человека — та часть биотехнологии, с которой каждый человек соприкасается чаще всего, хотя и не замечает этого.

• Любая современная вакцина прошла через клеточные культуры — на этапе получения штамма, производства или контроля.
• Диагностические тесты, от теста на беременность до анализа на антитела, работают на моноклональных антителах.
• Многие современные лекарства — белки, произведённые клетками CHO.
• Пересадка костного мозга, выращенная кожа для ожоговых больных, CAR-T-терапия — это клеточные технологии в клинике.
• Знание о пределе Хейфлика и теломерах помогает трезво относиться к обещаниям «вечной молодости»: продление жизни клетки в культуре и продление жизни организма — совершенно разные задачи.

Понимание основ позволяет отличать реальные достижения от преувеличений: например, видеть разницу между «вырастили органоид кишечника» и «вырастили кишечник для пересадки», между «клетки в чашке перестали стареть» и «найдено лекарство от старости».

26. Чем клетка в культуре отличается от клетки в организме

Полезно помнить: культура — упрощённая модель, и поведение клеток в ней отличается от поведения в теле. Понимание этих отличий объясняет и возможности метода, и его границы.

Последняя строка особенно важна. Клетки печени в культуре быстро перестают вырабатывать свойственные печени ферменты; нейроны в плоской культуре образуют не ту сеть, что в мозге; клетки эпителия теряют поляризацию. Поэтому результат, полученный на клетках, обязательно проверяют на более сложных моделях, а затем — в организме.

Именно стремление вернуть клеткам привычное окружение и породило трёхмерные культуры, органоиды, «орган-на-чипе» и среды с пониженным содержанием кислорода. Каждое такое усовершенствование приближает модель к живому организму — и делает её сложнее и дороже.

27. Что из этого спрашивают в школьном курсе

Тема культур клеток в школьном учебнике изложена кратко, поэтому полезно выделить тот минимум, который действительно нужен для экзамена, и отделить его от подробностей, интересных для расширения кругозора.

Экзаменационные задания почти всегда строятся вокруг левого столбца, но вопросы части 2 иногда требуют объяснить механизм — и тогда пригодится материал правого.

28. Как культура клеток изменила борьбу с полиомиелитом

Полиомиелит — вирусная болезнь, поражающая двигательные нейроны спинного мозга и вызывающая параличи, чаще у детей. В первой половине XX в. эпидемии полиомиелита были бедствием: тысячи детей оставались инвалидами, часть больных могла дышать только в аппарате искусственной вентиляции («железные лёгкие»).

Создать вакцину мешало одно: вирус умели размножать только в нервной ткани обезьян. Это было дорого, давало мало материала и опасно — примеси нервной ткани в препарате могли вызывать тяжёлые осложнения.

Перелом наступил в 1949 г., когда Эндерс, Уэллер и Роббинс показали, что вирус полиомиелита прекрасно размножается в культуре клеток кожи и мышц зародыша человека — то есть в ненервной ткани. Затем его размножили в клетках HeLa [3]. Теперь вирус можно было получать в нужных количествах, точно измерять его концентрацию и проверять действие сывороток.

Дальнейшее хорошо известно: инактивированная вакцина Джонаса Солка (1955) и живая ослабленная вакцина Альберта Сэйбина (начало 1960-х) практически вытеснили болезнь. В СССР живую вакцину испытывали и выпускали при участии М. П. Чумакова и А. А. Смородинцева; институт, созданный Чумаковым, стал одним из крупнейших производителей вакцины в мире. К настоящему времени полиомиелит ликвидирован почти повсеместно.

Эта история — хороший ответ на вопрос «зачем нужны культуры клеток»: без них не было бы ни вакцины против полиомиелита, ни против кори, краснухи, паротита, бешенства, гепатита A.

29. Небольшие, но важные детали

• Почему среду греют до 37 °С перед сменой. Резкое охлаждение разрушает микротрубочки цитоскелета и вызывает стресс; холодная среда замедляет обмен и ухудшает прикрепление клеток.
• Почему клетки отмывают от сыворотки перед трипсинизацией. В сыворотке есть ингибиторы протеаз, которые блокируют трипсин, и клетки не снимутся с поверхности.
• Почему после трипсинизации добавляют среду с сывороткой. Чтобы остановить действие трипсина: иначе он начнёт разрушать и сами клетки.
• Почему клетки нельзя пересевать слишком редко. Переросшая культура закисляет среду, клетки гибнут, а выжившие меняют свойства — возможен отбор быстрорастущих вариантов, и линия «дрейфует».
• Почему важно записывать номер пассажа. Результаты опытов на клетках 10-го и 50-го пассажа могут различаться; в протоколах производства номер пассажа строго ограничен.
• Почему во флаконе с культурой нельзя создавать сквозняк и резко двигать его. Колебания жидкости смывают только что прикрепившиеся клетки и приводят к неравномерному росту.

Эти мелочи складываются в главное правило работы с клетками: культура — живая система, и любые изменения условий она «запоминает» изменением своего состояния.

30. Трудности работы с животными клетками

Криобанк клеток

Клетки хранят в жидком азоте при −196 °С в среде с защитным веществом (чаще диметилсульфоксидом), которое не даёт воде образовать разрушительные кристаллы льда. Замораживают медленно (около 1 °С в минуту), а размораживают быстро, в тёплой воде. Так клеточные линии живут десятилетиями, и любой производственный цикл можно начать с одной и той же «точки отсчёта» — это важно для стандартности лекарств.

31. Культивируемое мясо

Отдельное направление, выросшее из культуры клеток, — производство мяса без убоя животных. Идея такова: из мышцы животного берут клетки-предшественники (клетки-сателлиты), размножают их в биореакторе, затем заставляют слиться в мышечные волокна на съедобном каркасе, добавляют жировые клетки — и получают мясной продукт.

Первый такой бургер был приготовлен и съеден публично в 2013 г.; его изготовление обошлось в сотни тысяч долларов. С тех пор стоимость снизилась в тысячи раз, а в нескольких странах продажа отдельных продуктов из культивируемого мяса разрешена. Главные трудности:

• дорогая среда — особенно факторы роста; их научились получать микробиологическим синтезом, что резко удешевило процесс;
• масштаб — нужны биореакторы, сравнимые по объёму с пивоваренными, но со стерильностью фармацевтического производства;
• структура — вырастить фарш проще, чем стейк с волокнами, жиром и сосудами;
• экономика и восприятие потребителями.

Для школьной биологии важно, что здесь работают те же законы: клеткам нужны питательная среда, кислород, температура 37 °С, стерильность, и они делятся ограниченное число раз, если не использовать особые линии.

32. Итог: что важно знать

• Культура клеток животных — выращивание клеток вне организма на среде с солями, глюкозой, аминокислотами, витаминами и сывороткой (или факторами роста) при 37 °С и 5 % CO₂.
• Клетки получают обработкой ткани трипсином; большинство из них прикрепляются к поверхности, делятся до сплошного слоя и останавливаются (контактное торможение); пересев делают трипсином.
• Предел Хейфлика: нормальные клетки делятся 40–60 раз, после чего стареют; причина — укорочение теломер. Опухолевые клетки и клетки с работающей теломеразой делятся неограниченно.
• Типы культур: первичная, диплоидный штамм, постоянная линия (HeLa, CHO, Vero), гибридома, стволовые клетки, органоиды.
• Главные применения: производство вакцин, белков-лекарств (CHO) и моноклональных антител, испытание лекарств, выращивание тканей для пересадки, клеточная терапия.
• Гибридома = B-лимфоцит (производит антитело) + миеломная клетка (бесконечно делится); даёт моноклональные антитела — одинаковые молекулы к одному эпитопу.
• Клетки животных, в отличие от растительных, не тотипотентны: целый организм из них получают только пересадкой ядра в яйцеклетку.
• Органоиды — трёхмерные миниатюрные модели органов из стволовых клеток; их размер ограничен отсутствием сосудов.

33. Частые ошибки

• «Из клетки человека в культуре можно вырастить человека». Специализированные клетки животных и человека не тотипотентны; организм можно получить только из зиготы, клеток раннего зародыша или пересадкой ядра в яйцеклетку.
• «Клеточные линии живут вечно». Нормальные клетки имеют предел Хейфлика (40–60 делений); неограниченно делятся опухолевые и специально «обессмерченные» линии.
• «Предел Хейфлика — это гибель клеток». Клетки остаются живыми и активными, но необратимо перестают делиться — это репликативное старение.
• «Гибридома — это гибрид человека и мыши». Гибридома — клетка, полученная слиянием B-лимфоцита и миеломной клетки; обе — клетки одного организма или близких линий.
• «Моноклональные антитела получают из крови животных». Из крови получают поликлональные антитела; моноклональные — из клона гибридомы или из культуры клеток CHO.
• «Вакцины делают только на куриных эмбрионах». Большинство современных вакцин производят в культурах клеток; куриные эмбрионы используют в основном для гриппозных вакцин.
• «Сыворотка в среде — это источник энергии». Источник энергии — глюкоза; сыворотка даёт факторы роста, гормоны и белки, необходимые для деления и прикрепления.
• «Контактное торможение — это гибель клеток при соприкосновении». Это остановка деления при образовании сплошного слоя; клетки остаются живыми. У опухолевых клеток оно нарушено.
• «Органоид — это выращенный орган, его можно пересадить». Органоид — миниатюрная модель органа размером в миллиметры, без сосудов; для пересадки он не предназначен.
• «Культура клеток полностью заменила опыты на животных». Она заменяет часть испытаний, но не воспроизводит работу целого организма.

34. Интересные факты

• Суммарная масса клеток HeLa, выращенных в лабораториях мира за десятилетия, по разным оценкам, многократно превышает массу тела самой Генриетты Лакс; эти клетки побывали даже на космических станциях.
• Клетки CHO, на которых держится производство большинства белковых лекарств, ведут происхождение от небольшой пробы ткани одного хомячка, взятой в 1957 г.
• Феноловый красный в среде — простейший «датчик»: по оттенку розового биотехнолог на глаз определяет, не пора ли менять среду.
• Трипсин, которым снимают клетки с поверхности, — тот же пищеварительный фермент поджелудочной железы, который расщепляет белки пищи.
• Клетки, выращенные в невесомости, образуют более правильные трёхмерные структуры, потому что не оседают на дно; опыты по культивированию тканей ставят на космических станциях.
• Среда Игла, разработанная в 1955 г., содержала 29 компонентов, подобранных экспериментально; её варианты используются до сих пор.
• Моноклональные антитела в тесте на беременность работают так: одно антитело ловит гормон, второе, с окрашенной меткой, прикрепляется к нему — и на полоске появляется цветная линия.
• Чтобы проверить, не заражена ли культура микоплазмами, используют ПЦР или окрашивание ДНК: микоплазмы видны как мелкие точки вокруг ядер клеток.

35. Частые вопросы

Почему клетки животных растут в 5 % CO₂?

В среде используется гидрокарбонатный буфер — та же система, что поддерживает pH крови. Он работает только при определённом содержании углекислого газа в атмосфере над средой. Если вынести флакон из инкубатора надолго, CO₂ уйдёт, среда защелочится и порозовеет.

Зачем нужна сыворотка и почему от неё стараются отказаться?

Сыворотка содержит факторы роста, гормоны, белки-переносчики и вещества, помогающие клеткам прикрепляться. Отказываются потому, что она дорога, непостоянна по составу от партии к партии, может содержать вирусы и затрудняет очистку продукта. Замена — среды с набором известных рекомбинантных белков.

Чем первичная культура отличается от линии?

Первичная культура получена прямо из ткани, содержит разные типы клеток и живёт недолго. Линия — потомство клеток, приспособившихся к росту в культуре; диплоидная линия имеет нормальный кариотип и ограниченный срок жизни, постоянная линия делится неограниченно, но её кариотип изменён.

Почему опухолевые клетки удобны для биотехнологии и чем они опасны?

Они быстро растут, делятся неограниченно, нетребовательны. Опасность — изменённый кариотип и способность к неограниченному росту: препараты, полученные на таких клетках, тщательно очищают от клеточной ДНК и белков, а сами клетки в препарат попадать не должны.

Можно ли вырастить в культуре целый орган для пересадки?

Пока нет. Главное препятствие — кровеносные сосуды: без них толщина живой ткани ограничена долями миллиметра, глубже клетки не получают кислорода. Удаётся выращивать тонкие ткани — кожу, роговицу, хрящ, участки сосудов. Исследуются каркасы из «очищенных» органов, биопечать с сосудистыми каналами, выращивание органов в организме животных — но до клинического применения ещё далеко.

Чем отличается клеточная терапия от генной?

При клеточной терапии пациенту вводят клетки (свои или донорские), при генной — изменяют гены в его клетках. Часто эти подходы сочетаются: при CAR-T-терапии у больного берут T-лимфоциты, вводят в них ген рецептора (генная инженерия), размножают в культуре и возвращают пациенту (клеточная терапия).

Почему моноклональные антитела такие дорогие?

Их производят в клетках млекопитающих — процесс долгий (две недели ферментации), требует дорогой среды и строжайшей чистоты; на одну дозу нужны граммы белка; очистка и контроль занимают значительную часть затрат. Кроме того, в цену входят затраты на разработку и испытания препарата.

Что такое «клеточный банк» и зачем он нужен?

Это запас замороженных ампул одного клона клеток: главный банк, из которого изредка берут ампулы для создания рабочего банка, и рабочий банк, с которого начинают производственные циклы. Такая система гарантирует, что лекарство, выпущенное через десять лет, производится теми же клетками, что и сегодня.

36. ЕГЭ

Тема относится к элементу 3.7 кодификатора [1]: «Объекты, используемые в биотехнологии, – клеточные и тканевые культуры, микроорганизмы, их характеристика», а также к разделам «Медицинские биотехнологии» и «Использование стволовых клеток». Она опирается на знания о строении клетки, о митозе, об иммунитете и о вирусах.

Что обязательно знать

• Что такое культура клеток животных, какие условия ей нужны (37 °С, 5 % CO₂, стерильность, среда с глюкозой, аминокислотами, сывороткой).
• Отличия культур животных и растительных клеток, прежде всего отсутствие тотипотентности.
• Предел Хейфлика и его причину (укорочение теломер).
• Что такое гибридома и моноклональные антитела, как их получают и где применяют.
• Роль клеточных культур в производстве вакцин и белков-лекарств.
• Примеры применения в медицине: выращивание кожи, пересадка кроветворных клеток.

Разбор типичных формулировок

«Установите соответствие между объектом и получаемым продуктом». Гибридома — моноклональные антитела; клетки CHO — белки-лекарства (антитела, эритропоэтин); культура клеток почки обезьяны — вакцины; культура меристемы растения — безвирусный посадочный материал; бактерия с геном человека — инсулин.

«Выберите три верных утверждения о культуре клеток животных». Верные: клетки выращивают при 37 °С; в среду добавляют сыворотку крови; большинство клеток прикрепляются к поверхности; нормальные клетки делятся ограниченное число раз. Ловушки: «клетки тотипотентны», «из культуры можно вырастить организм», «в среду добавляют фитогормоны».

Часть 2: «Почему белки человека со сложным строением получают в культуре клеток млекопитающих, а не в бактериях?» Элементы ответа: 1) у бактерий нет ЭПС и комплекса Гольджи; 2) они не присоединяют к белку углеводные цепи и не обеспечивают правильную укладку; 3) без этого белок неактивен или вызывает иммунный ответ; 4) клетки млекопитающих обрабатывают белок так же, как клетки человека.

Часть 2: «В чём преимущества моноклональных антител перед поликлональными?» Элементы: 1) они абсолютно одинаковы и узнают один участок антигена; 2) их можно производить в неограниченных количествах постоянного качества; 3) это обеспечивает точность диагностики и предсказуемость действия лекарства.

37. Для олимпиад

Сколько клеток можно получить

Если клетки делятся раз в сутки, то за n суток их число растёт как 2ⁿ. Но в жизни культура ограничена площадью: клетки останавливаются, покрыв дно. Во флаконе с площадью дна 75 см² при плотности около 10⁵ клеток на см² помещается примерно 7,5 · 10⁶ клеток. Чтобы получить 10⁹ клеток, нужно около 130 таких флаконов — или биореактор с микроносителями.

Пример. Микроноситель — шарик диаметром 200 мкм. Площадь одного шарика: S = πd² ≈ 3,14 · (2 · 10⁻² см)² ≈ 1,26 · 10⁻³ см². В литре среды с 5 г микроносителей (а это миллионы шариков) суммарная поверхность достигает нескольких тысяч квадратных сантиметров — больше, чем у десятков флаконов. Так небольшой биореактор заменяет целую комнату с флаконами.

Предел Хейфлика в числах

Пусть клетка делится 50 раз. Теоретически из одной клетки получится 2⁵⁰ ≈ 1,1 · 10¹⁵ клеток — это масса порядка тонны. На практике столько не вырастить: часть клеток гибнет, часть не делится. Но расчёт объясняет, почему предела Хейфлика хватает и для организма (в теле человека около 3 · 10¹³ клеток), и для наработки клеток в лаборатории.

Теломеры: оценка

Теломеры человека при рождении имеют длину порядка 10 тысяч пар нуклеотидов и укорачиваются примерно на 50–100 пар за деление. Отсюда: 10 000 / 70 ≈ 140 делений до полного исчерпания. Клетка, однако, останавливается раньше — при длине около 4–5 тысяч пар, что соответствует 50–80 делениям, то есть пределу Хейфлика.

Почему гибридомы отбирают именно на селективной среде

Селективная среда содержит вещество, блокирующее основной путь синтеза нуклеотидов. Клетки могут выжить, только воспользовавшись запасным путём, для которого нужен определённый фермент. У миеломных клеток, выбранных для слияния, этот фермент отсутствует — поэтому несслившиеся миеломные клетки погибают. Несслившиеся лимфоциты фермент имеют, но сами по себе в культуре не делятся и вскоре отмирают. Гибридома получает фермент от лимфоцита, а способность делиться — от миеломной клетки, и потому выживает одна. Это классический пример комплементации: соединение двух клеток, каждой из которых чего-то не хватает, даёт жизнеспособную клетку.

Задача на понимание

Исследователь обнаружил, что его культура «нормальных» фибробластов делится уже 200 раз и не собирается останавливаться, а в кариотипе появились лишние хромосомы. Что произошло? Ответ: произошла спонтанная трансформация — клетки «обессмертились», включив теломеразу и утратив контроль деления; такая культура уже не является нормальной диплоидной и не годится для опытов, где нужны нормальные клетки. Второй возможный вариант — культура загрязнена другой, постоянной линией; это проверяют анализом подлинности.

38. Задания с разбором

Задание 1

Что такое культура клеток животных? Назовите не менее четырёх компонентов среды для них.

Задание 2

Почему из клетки растения можно получить растение, а из клетки животного организм обычно получить нельзя?

Задание 3

Что такое предел Хейфлика и чем он объясняется?

Задание 4

Чем постоянная клеточная линия отличается от диплоидного штамма?

Задание 5

Что такое гибридома и как её получают?

Задание 6

Чем моноклональные антитела отличаются от поликлональных и где их применяют?

Задание 7

Почему вакцины выгодно производить в культуре клеток, а не в организме животных?

Задание 8

Найдите ошибки и исправьте: 1) Клетки животных в культуре выращивают при 37 °С. 2) Нормальные клетки делятся в культуре неограниченно. 3) В среду добавляют сыворотку крови. 4) Из клетки кожи человека в культуре можно вырастить человека. 5) Гибридома производит моноклональные антитела.

Задание 9

Что такое контактное торможение? У каких клеток оно нарушено?

Задание 10

Зачем клетки обрабатывают трипсином?

Задание 11

Установите соответствие между линией и её применением: А) CHO; Б) Vero; В) гибридома; Г) MRC-5; Д) HeLa. Применение: 1) производство моноклональных антител; 2) производство белков-лекарств; 3) вакцины на диплоидных клетках человека; 4) вакцины на клетках обезьяны; 5) первая постоянная линия клеток человека, модель для исследований.

Задание 12

Почему при длительной работе с культурами обязательно проверяют их подлинность?

Задание 13

Как выращивают кожу для пересадки при ожогах?

Задание 14

Что такое органоид? Почему его нельзя вырастить до размеров настоящего органа?

Задание 15

Зачем в инкубаторе поддерживают 5 % углекислого газа?

Задание 16

Назовите не менее трёх применений культур клеток в медицине.

Задание 17

Почему культуру клеток нельзя считать полной заменой опытов на животных?

Задание 18

Зачем создают банк замороженных клеток продуцента?

Задание 19 (олимпиадное)

Клетки делятся раз в 24 часа. В лаборатории нужно получить 10⁹ клеток, начав с 10⁶. Сколько суток потребуется? Какую площадь должны занять эти клетки при плотности 10⁵ клеток/см²? Сколько флаконов по 75 см² это составит и чем их выгодно заменить?

Задание 20 (олимпиадное)

Теломеры при рождении имеют длину около 10 000 пар нуклеотидов и укорачиваются на 70 пар за деление, а деление прекращается при длине около 5000 пар. Сколько делений это допускает? Как согласуется результат с пределом Хейфлика? Почему половые и опухолевые клетки не подчиняются этому ограничению?

Литература

1. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.
2. Hayflick L., Moorhead P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains // Experimental Cell Research. 1961. Vol. 25, № 3. P. 585–621. DOI: 10.1016/0014-4827(61)90192-6.
3. Scherer W. F., Syverton J. T., Gey G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) // Journal of Experimental Medicine. 1953. Vol. 97, № 5. P. 695–710. DOI: 10.1084/jem.97.5.695.
4. Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks 2014 // Nature Biotechnology. 2014. Vol. 32, № 10. P. 992–1000. DOI: 10.1038/nbt.3040.
5. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. Vol. 256, № 5517. P. 495–497. DOI: 10.1038/256495a0.
6. Sato T., Vries R. G., Snippert H. J. et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche // Nature. 2009. Vol. 459, № 7244. P. 262–265. DOI: 10.1038/nature07935.
7. Lancaster M. A., Knoblich J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies // Science. 2014. Vol. 345, № 6194. Art. 1247125. DOI: 10.1126/science.1247125.