Культуры клеток и тканей растений

Из кусочка ткани моркови в пробирке можно вырастить целое растение. Из верхушки побега картофеля, очищенной от вирусов, — миллионы здоровых клубней. Из двух клеток разных видов, лишённых оболочек, — гибрид, который никогда не получился бы при опылении. Всё это возможно потому, что клетки растений сохраняют тотипотентность — способность дать начало целому организму. В этой статье серии «Биотехнология» разбираем культуры клеток и тканей растений: как их выращивают, зачем и что они дают сельскому хозяйству и промышленности.

• 1. Что такое культура клеток и тканей
• 2. Тотипотентность — ключ ко всему
• 3. Питательная среда
• 4. Фитогормоны: как управляют развитием
• 5. Каллус: что это и как его получают
• 6. Микроклональное размножение
• 7. Оздоровление растений от вирусов
• 8. Протопласты и соматическая гибридизация
• 9. Гаплоиды из пыльников
• 10. Вещества из культур растительных клеток
• 11. Культура клеток в селекции растений
• 12. Сохранение генетических ресурсов
• 13. Растительные и животные культуры: сравнение
• 14. История метода
• 15. Как устроена лаборатория культуры тканей
• 16. Трудности культивирования и их причины
• 17. Культура тканей в нашей стране
• 18. Как культура клеток служит генной инженерии растений
• 19. Где культура тканей уже изменила практику
• 20. Словарь темы
• 21. Вирусы растений: почему с ними так трудно бороться
• 22. Как выглядит работа в культуре тканей
• 23. Что происходит в клетке при переходе в культуру
• 24. Что дальше
• 25. Выбор экспланта: почему он так важен
• 26. Способы размножения растений: где место культуры тканей
• 27. Экономика питомника: когда культура тканей окупается
• 28. Итог: что важно знать
• 29. Частые ошибки
• 30. Интересные факты
• 31. Частые вопросы
• 32. ЕГЭ
• 33. Для олимпиад
• 34. Задания с разбором
• Литература

1. Что такое культура клеток и тканей

Культура клеток и тканей растений — выращивание изолированных клеток, тканей или органов растения на искусственной питательной среде в стерильных условиях. Латинское выражение in vitro («в стекле») означает «в пробирке», в отличие от in vivo — «в живом организме».

Кодификатор называет «клеточные и тканевые культуры» среди главных объектов биотехнологии [1]. Для растений это направление стало особенно плодотворным — именно благодаря тотипотентности их клеток.

Что можно культивировать

2. Тотипотентность — ключ ко всему

Тотипотентность — способность клетки дать начало целому организму. Все клетки одного растения содержат одинаковый набор генов: клетка листа, корня и лепестка отличаются не генами, а тем, какие гены в них работают. Если специализированную клетку вернуть в «нулевое состояние», она может начать развитие заново.

У растений это свойство сохраняется у множества живых клеток паренхимы — отчасти потому, что растение неподвижно и должно уметь восстанавливаться после повреждений: отрастать от пня, укореняться черенком, давать поросль. У животных способность к такому полному восстановлению утрачена специализированными клетками: там целый организм можно получить только из зиготы, клеток раннего зародыша или через пересадку ядра в яйцеклетку.

Доказательство: морковь из одной клетки

Решающий опыт провёл в 1950-х гг. Фредерик Стюард с сотрудниками. Из корнеплода моркови вырезали кусочки ткани, поместили в жидкую среду с кокосовым молоком (жидким эндоспермом кокосового ореха, богатым стимуляторами деления) и встряхивали. Клетки отделялись друг от друга, делились, образовывали зародышеподобные структуры, а из них вырастали целые растения моркови, которые затем зацветали и давали семена [2]. Так было доказано, что одиночная специализированная клетка растения сохраняет всю программу развития.

Дедифференцировка и редифференцировка

• Дедифференцировка — «обратный ход»: специализированная клетка теряет особенности своей ткани, возвращается к способности делиться и образует каллус.
• Редифференцировка — образование из каллуса новых структур: корней, побегов, зародышеподобных телец.

Переключение между ними задаётся составом среды, прежде всего соотношением фитогормонов.

3. Питательная среда

Среда для растительных клеток должна заменить им всё, что в целом растении обеспечивают корни, листья и сосудистая система.

Самая известная среда — среда Мурасиге и Скуга (MS), разработанная в 1962 г. для культуры тканей табака [3]; её отличает высокое содержание минеральных солей. С небольшими изменениями она используется для сотен видов растений и до сих пор остаётся стандартом.

Среду стерилизуют в автоклаве, разливают в пробирки, колбы или специальные сосуды, а все работы ведут в ламинарном боксе со стерильным потоком воздуха. Культуры выращивают в помещениях с заданной температурой (обычно 22–26 °С) и освещением с заданной длиной светового дня.

4. Фитогормоны: как управляют развитием

Два главных класса фитогормонов в культуре тканей:

• Ауксины (природный — индолилуксусная кислота; в культуре чаще используют синтетические 2,4-Д, НУК) вызывают деление клеток и образование корней.
• Цитокинины (кинетин, 6-бензиламинопурин, зеатин) вызывают деление клеток и образование побегов.

Решающим оказалось открытие Фольке Скуга и Карлоса Миллера (1950-е гг.): развитие определяется не самими гормонами, а их соотношением.

Это правило — рабочий инструмент: меняя среду на каждом этапе, из одного кусочка ткани последовательно получают каллус, затем побеги, затем укоренённые растения.

5. Каллус: что это и как его получают

Каллус — масса рыхло соединённых слабо специализированных клеток. В природе каллус образуется на раневой поверхности: на срезе ветки, у места прививки. В культуре его получают так:

1. Выбирают эксплант — кусочек ткани: отрезок стебля, фрагмент листа, зародыш, кусочек клубня. Молодые ткани дают каллус легче.
2. Стерилизуют поверхность экспланта: обрабатывают спиртом и раствором гипохлорита, промывают стерильной водой. Задача — убить микробов на поверхности, не повредив ткань.
3. Помещают на среду с ауксином и цитокинином.
4. Через 2–4 недели на поверхности экспланта разрастается каллус; его отделяют и пересаживают на свежую среду (пассируют) каждые 3–6 недель.

Каллусные культуры живут годами, но у них есть особенность: при долгом выращивании в клетках накапливаются изменения числа и строения хромосом — сомаклональная изменчивость. Для размножения сортов это недостаток (растения могут оказаться неодинаковыми), а для селекции — источник нового разнообразия: среди сомаклонов иногда находят формы с полезными свойствами.

Суспензионные культуры

Если рыхлый каллус поместить в жидкую среду и постоянно встряхивать или перемешивать, он распадается на отдельные клетки и их группы — получается суспензионная культура. Её можно выращивать в ферментёрах, как микроорганизмы. Правда, растительные клетки растут медленнее микробных (деление за сутки и более), крупнее и чувствительнее к механическим повреждениям, поэтому аппараты для них перемешивают мягче.

6. Микроклональное размножение

Микроклональное размножение (клональное микроразмножение) — получение в культуре большого числа растений, генетически идентичных исходному. Это самое массовое применение культуры тканей: в мире так выращивают сотни миллионов растений в год.

Зачем оно нужно

• Скорость. Из одного растения за год можно получить тысячи и миллионы потомков, тогда как черенкованием — десятки.
• Одинаковость. Все растения — клоны: сохраняются все свойства сорта, включая гетерозис у гибридов.
• Здоровье. Материал свободен от вирусов, бактерий, грибов, нематод.
• Круглый год и независимо от сезона и погоды; компактно — тысячи растений на стеллажах одной комнаты.
• Трудноразмножаемые виды. Орхидеи, многие декоративные и лесные породы, некоторые сорта плодовых почти не дают черенков или семян нужного качества.

Четыре этапа

1. Введение в культуру. Отбирают здоровое растение, вырезают эксплант (чаще верхушечную или пазушную почку), стерилизуют, помещают на среду. Главная трудность — внутренняя инфекция и выделение фенольных веществ, от которых ткань темнеет и гибнет.
2. Размножение (пролиферация). На среде с повышенным содержанием цитокининов почка даёт множество побегов; их делят и снова помещают на ту же среду. Число растений растёт в геометрической прогрессии: цикл 3–6 недель, коэффициент размножения 3–10 за цикл.
3. Укоренение. Побеги переносят на среду с ауксином и без цитокинина; за 2–4 недели образуются корни.
4. Адаптация (акклиматизация). Самый уязвимый этап. В пробирке растение жило при полной влажности, на готовом сахаре, с недоразвитыми устьицами и тонким восковым налётом. Его переносят в субстрат, накрывают плёнкой и постепенно снижают влажность, приучая к самостоятельному фотосинтезу и испарению.

Два пути размножения

• Через пазушные почки — активация уже существующих почек. Самый надёжный способ: растения получаются генетически одинаковыми, так как новых клеточных линий не возникает.
• Через каллус или соматический эмбриогенез — больше потомков за цикл, но выше риск сомаклональной изменчивости.

Поэтому для размножения сортов предпочитают первый путь, а каллусные культуры используют там, где изменчивость не мешает или даже нужна.

Соматический эмбриогенез

Из соматических (не половых) клеток в культуре могут образовываться структуры, похожие на зародыши семени, — соматические зародыши. Они проходят те же стадии, что зародыш в семени, и дают растения без оплодотворения. Их удобно размножать в жидкой среде в больших объёмах и даже «упаковывать» в гель, получая искусственные семена, которые можно высевать машинами. Так размножают, например, хвойные для лесовосстановления и некоторые гибриды.

Кого размножают в культуре

Картофель, землянику, малину, голубику, плодовые подвои, виноград, банан, сахарный тростник, орхидеи, фикусы, антуриумы, хвойные, эвкалипты, финиковую пальму. Для банана это основной способ: культурные сорта бессемянные и стерильные, их размножают только вегетативно.

7. Оздоровление растений от вирусов

Вегетативно размножаемые растения — картофель, земляника, чеснок, плодовые, цветочные культуры — накапливают вирусы из поколения в поколение. Вирус переходит с клубнем, усом, черенком и постепенно заражает весь посадочный материал. Внешне растение может выглядеть здоровым, но давать на 10–50 % меньше урожая. Это явление называют вырождением сорта.

Идея метода

Вирусы распространяются по растению по сосудам и от клетки к клетке через плазмодесмы. В самой верхушке побега — в апикальной меристеме — сосудов ещё нет, клетки делятся очень быстро, а вирусных частиц там мало или нет совсем: вирус не успевает за делением клеток. Значит, если вырезать крошечный кусочек верхушки (0,1–0,5 мм, с одним-двумя зачатками листьев) и вырастить из него растение, оно может оказаться свободным от вируса.

Метод предложил в начале 1950-х гг. французский исследователь Жорж Морель, работая с георгинами, а затем с орхидеями; он же обнаружил, что меристемы орхидей в культуре дают множество «протокормов», из которых вырастают растения, — так родилось и микроклональное размножение.

Как повышают надёжность

• Термотерапия: растение-донор перед вырезанием меристемы несколько недель содержат при 35–38 °С. Размножение многих вирусов при такой температуре замедляется, а растение ещё растёт — зона, свободная от вируса, расширяется.
• Хемотерапия: в среду добавляют вещества, подавляющие размножение вирусов.
• Криотерапия: верхушки обрабатывают сверхнизкой температурой — выживают преимущественно мелкие клетки меристемы, свободные от вируса.
• Проверка: каждое полученное растение обязательно тестируют на вирусы — иммуноферментным анализом или ПЦР. Свободным считают только проверенное растение.

Система семеноводства картофеля

На оздоровлении построена современная схема производства семенного картофеля: меристемная пробирочная культура → микрорастения и микроклубни в теплице с защитой от тли → мини-клубни → супер-суперэлита → суперэлита → элита → репродукции для товарных посадок. На каждом этапе растения проверяют на вирусы, а число репродукций ограничивают: чем дольше сорт размножают в поле, тем больше он накапливает инфекций. Безвирусный посадочный материал повышает урожайность на десятки процентов.

8. Протопласты и соматическая гибридизация

Протопласт — клетка растения, лишённая клеточной стенки: мембрана с цитоплазмой, ядром и органоидами. Стенка мешает клеткам сливаться и затрудняет введение в них ДНК, поэтому её убирают.

Как получают протопласты

Кусочки листа или суспензионную культуру обрабатывают смесью ферментов: целлюлазой (расщепляет целлюлозу) и пектиназой (расщепляет пектин срединных пластинок, склеивающий клетки). Чтобы голые протопласты не лопнули, раствор делают гипертоническим — добавляют маннит или сорбит, создавая осмотическое давление, уравновешивающее давление внутри клетки. Через несколько часов клетки освобождаются от стенок и становятся шарообразными. Их отмывают и переносят в среду. Если условия подобраны верно, протопласт за несколько дней строит новую стенку, начинает делиться и даёт микроколонию, затем каллус и растение. Впервые целые растения табака из протопластов получили в начале 1970-х гг. [4], [5].

Соматическая гибридизация

Два протопласта разных видов можно заставить слиться — электрическим импульсом или химически (раствором полиэтиленгликоля). Получается клетка с двумя наборами хромосом от разных растений; из неё выращивают соматический гибрид.

Чем это ценно: половое скрещивание возможно только между близкими видами, а слияние протопластов позволяет соединять геномы растений, которые не скрещиваются. Классический опытный пример — гибрид картофеля и томата («помато», «томофель»): растение получено, но практического значения не имеет — оно даёт мелкие клубни и невкусные плоды. Зато соматическая гибридизация оказалась полезна в селекции: от дикого родича культурному растению так передают устойчивость к болезням, устойчивость к холоду, цитоплазматическую мужскую стерильность для производства гибридных семян.

Отдельная возможность — перенос цитоплазмы. Если один из протопластов перед слиянием облучить, его ядро разрушается, но митохондрии и пластиды остаются: получается растение с ядром одного родителя и цитоплазмой другого (цибрид). Так передают признаки, наследуемые по материнской линии.

9. Гаплоиды из пыльников

Если поместить в культуру пыльники или отдельные пыльцевые зёрна, микроспоры при определённых условиях (часто после кратковременного температурного стресса) переключаются с развития пыльцы на деление и образование зародышеподобных структур. Из них вырастают гаплоидные растения — с одинарным набором хромосом.

Гаплоид слаб и бесплоден, но если обработать его колхицином, число хромосом удвоится и получится удвоенный гаплоид — абсолютно гомозиготное растение, плодовитое и генетически однородное.

Зачем это нужно: обычная селекция получает чистые линии самоопылением в течение 6–8 поколений, то есть многих лет. Метод удвоенных гаплоидов даёт чистую линию за один цикл. Поэтому он широко используется в селекции ячменя, пшеницы, рапса, кукурузы, перца, табака. Кроме того, у гаплоида сразу виден эффект любой, в том числе рецессивной, мутации.

10. Вещества из культур растительных клеток

Растения синтезируют десятки тысяч веществ, многие из которых стали лекарствами, красителями, душистыми веществами. Но собирать их из растений не всегда удобно: растение растёт медленно, зависит от климата, иногда редко или охраняется, а содержание вещества колеблется. Альтернатива — выращивать клетки растений в ферментёре.

Трудности: растительные клетки растут медленно; вторичные метаболиты часто образуются только в специализированных тканях (в корнях, в млечниках), а в неорганизованном каллусе — плохо; культуры нестабильны по продуктивности. Поэтому используют приёмы: элиситоры (вещества, имитирующие нападение патогена и запускающие защитный синтез), двухстадийное выращивание (сначала рост, потом синтез), иммобилизацию клеток, а также культуры «бородатых корней» — корней, полученных заражением агробактерией Rhizobium rhizogenes; они растут быстро, не требуют гормонов и устойчиво синтезируют вещества, свойственные корням.

Экономически такие производства оправданы для дорогих веществ, которые трудно получить иначе: для дешёвых ароматизаторов проще химический синтез или выращивание растений в поле.

11. Культура клеток в селекции растений

Культура тканей дала селекционерам несколько мощных приёмов.

• Клеточная селекция. Миллионы клеток в чашке — это как бы миллионы «растений» на одном столе. Если добавить в среду соль, тяжёлый металл, токсин возбудителя болезни или гербицид, выживут лишь устойчивые клетки. Из них выращивают растения и проверяют, сохранилась ли устойчивость в целом растении и передаётся ли она потомству. Так получали формы, устойчивые к засолению, к некоторым болезням.
• Сомаклональная изменчивость. Изменения, возникающие при длительном культивировании, иногда дают полезные формы — например, с изменённым сроком созревания или устойчивостью к болезни.
• Спасение зародышей. При скрещивании далёких видов зародыш часто гибнет на ранних стадиях, потому что не развивается эндосперм. Если вырезать такой зародыш и вырастить его в культуре на питательной среде, гибридное растение удаётся получить. Этим приёмом пользуются при отдалённой гибридизации, в том числе при создании тритикале и при передаче культурным растениям генов диких родичей.
• Удвоенные гаплоиды — быстрое получение чистых линий (см. выше).
• Соматическая гибридизация — соединение геномов нескрещивающихся видов.
• Генная инженерия. Любое трансгенное растение проходит через культуру клеток: ген вводят в клетки, отбирают трансформированные и регенерируют из них растение. Без тотипотентности и культуры тканей генная инженерия растений была бы невозможна.

12. Сохранение генетических ресурсов

Семенные банки хорошо хранят семена зерновых и бобовых. Но у многих растений семена либо не выдерживают высушивания и замораживания (какао, кофе, манго, каштан), либо сорт нужно сохранять вегетативно, потому что он гетерозиготен и из семян не воспроизводится (картофель, плодовые, виноград).

Для них используют два способа:

• Коллекции in vitro — пробирочные растения, растущие медленно при пониженной температуре (4–10 °С) и на среде с осмотически активными веществами; пересаживают их раз в несколько месяцев или лет.
• Криоконсервация — хранение меристем, зародышей или клеток в жидком азоте при −196 °С. При такой температуре биохимические процессы практически прекращаются, и материал можно хранить неограниченно долго. Главная трудность — не дать воде в клетках образовать кристаллы льда, разрывающие мембраны. Для этого применяют витрификацию: клетки обрабатывают концентрированными защитными растворами и охлаждают так быстро, что вода переходит в стеклообразное состояние, минуя кристаллизацию.

Крупнейшие пробирочные и криоколлекции мира хранят тысячи сортов картофеля, батата, банана, маниока; в России коллекции поддерживает в том числе Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н. И. Вавилова.

13. Растительные и животные культуры: сравнение

О культурах животных клеток — следующая статья серии.

14. История метода

• 1838–1839 — Маттиас Шлейден и Теодор Шванн формулируют клеточную теорию; появляется мысль, что клетка способна к самостоятельной жизни.
• 1902 — Готлиб Габерландт впервые пытается выращивать изолированные клетки растений и высказывает идею тотипотентности. Его опыты не удались: он взял сильно специализированные клетки и не знал о фитогормонах.
• 1922 — В. Роббинс и У. Котт независимо выращивают изолированные кончики корней.
• 1934–1939 — Филип Уайт, Роже Готре и Пьер Нобекур получают долгоживущие культуры: Готре поддерживал культуру ткани моркови десятилетиями. Открытие ауксина (индолилуксусной кислоты) позволило наладить рост каллуса.
• 1955–1957 — Карлос Миллер и Фольке Скуг открывают кинетин — первый цитокинин — и формулируют правило: соотношение ауксинов и цитокининов определяет образование корней или побегов.
• 1952–1960 — Жорж Морель с сотрудниками получает безвирусные растения из меристем и налаживает размножение орхидей.
• 1958 — Фредерик Стюард выращивает растения моркови из отдельных клеток, доказывая тотипотентность [2].
• 1960 — Эдвард Кокинг получает протопласты с помощью ферментов.
• 1962 — Тосио Мурасиге и Фольке Скуг публикуют состав среды, ставшей стандартом [3].
• 1964 — С. Гуха и С. Махешвари получают гаплоиды из пыльников дурмана.
• 1970–1971 — из протопластов табака получены целые растения [4], [5]; вскоре протопласты разных видов научились сливать.
• 1983 — в Японии налажено промышленное производство шиконина в культуре клеток; в мире получены первые трансгенные растения.
• 1990-е — наши дни — промышленное микроклональное размножение, криобанки, культура клеток для производства паклитаксела, редактирование генома через культуру клеток.

В нашей стране большой вклад в развитие культуры тканей внесли работы Р. Г. Бутенко и её школы: разработаны методы клонального микроразмножения, оздоровления картофеля, получения веществ в культуре клеток женьшеня.

15. Как устроена лаборатория культуры тканей

Промышленная лаборатория микроклонального размножения — это небольшой завод, и её устройство подчинено одной задаче: не допустить микробов туда, где они погубят культуру.

Главная статья расходов — ручной труд: пересадку растений делает человек пинцетом и скальпелем, и один работник за смену пересаживает несколько сотен побегов. Поэтому себестоимость пробирочного растения заметно выше, чем черенка, и метод выгоден для ценных культур либо там, где другого способа нет.

Чем удешевляют производство

• Биореакторы временного погружения. Растения растут в сосуде, который периодически заливается жидкой средой и снова освобождается от неё. Среда не требует агара (а он — заметная часть стоимости), растения растут быстрее, а пересадок нужно меньше.
• Фотоавтотрофное культивирование. Если дать яркий свет, повышенное содержание CO₂ и вентиляцию через фильтры, растения переходят на собственный фотосинтез. Сахар в среду можно не добавлять — а значит, резко падает риск заражения, ведь без сахара микробам в среде нечем питаться. Растения получаются крепче и легче проходят адаптацию.
• Автоматизация. Механизированные линии разлива сред, машинное зрение для отбора побегов, роботы-манипуляторы — пока применяются ограниченно.

16. Трудности культивирования и их причины

Культура тканей — тонкое дело; большинство неудач объясняется несколькими типичными причинами.

Обратите внимание: почти каждое решение — это подбор условий. Универсального «рецепта» для всех растений нет; для каждого вида и даже сорта среду и режим подбирают опытным путём. Поэтому в литературе по культуре тканей так много статей вида «условия регенерации для такого-то сорта».

17. Культура тканей в нашей стране

Школа культуры клеток растений в нашей стране связана прежде всего с именем Раисы Георгиевны Бутенко (1920–2004), работавшей в Институте физиологии растений имени К. А. Тимирязева. Её труды заложили основы метода в СССР: изучение гормональной регуляции развития в культуре, получение культур клеток женьшеня как источника биологически активных веществ, разработка методов клонального микроразмножения и оздоровления картофеля, подготовка учебников, по которым учились несколько поколений биотехнологов.

Сегодня в России культура тканей применяется:

• в семеноводстве картофеля — лаборатории при институтах и семеноводческих хозяйствах производят пробирочные растения и мини-клубни;
• в питомниководстве — размножение подвоев плодовых, земляники, малины, голубики, роз, декоративных культур;
• в лесном хозяйстве — размножение ценных форм хвойных и берёзы;
• в коллекциях генетических ресурсов — пробирочные и криоколлекции;
• в селекции — гаплоидия у ячменя и пшеницы, спасение зародышей, клеточная селекция.

Отдельное направление — получение веществ: культуры клеток женьшеня и других лекарственных растений используются для производства биологически активных добавок и косметических средств.

18. Как культура клеток служит генной инженерии растений

Любое генно-модифицированное или отредактированное растение рождается в пробирке. Схема такова.

1. Подготовка конструкции. Нужный ген соединяют с регуляторными участками (промотором, терминатором) и с геном-маркёром, по которому потом отбирают трансформированные клетки, — например, геном устойчивости к антибиотику или гербициду.
2. Доставка в клетку. Основных способов два. Агробактериальная трансформация: используют природную способность Agrobacterium tumefaciens переносить в растительную клетку участок своей плазмиды и встраивать его в хромосому. Вредные гены из плазмиды удаляют, а на их место ставят нужные. Биобаллистика («генная пушка»): частицы золота или вольфрама, покрытые ДНК, с огромной скоростью выстреливают в ткань; часть ДНК попадает в ядра. Этот способ выручает там, где агробактерия работает плохо, — у злаков. Протопласты можно трансформировать и напрямую — электропорацией или полиэтиленгликолем.
3. Отбор. Клетки выращивают на среде с антибиотиком или гербицидом: выживают только те, что получили конструкцию.
4. Регенерация. Из отобранных клеток через каллус или прямую регенерацию получают растения — и здесь всё держится на тотипотентности.
5. Проверка и размножение. Подтверждают встраивание гена и его работу, проверяют, что признак передаётся потомству, затем размножают линию.

Современное редактирование генома идёт по той же схеме, но с важным отличием: в клетку можно ввести не ДНК, а готовый белково-РНК комплекс, который внесёт изменение в собственный ген растения и быстро разрушится. Тогда в полученном растении не останется чужеродной ДНК. Особенно удобны для этого протопласты: в них комплекс вводят напрямую, а затем регенерируют растения.

19. Где культура тканей уже изменила практику

20. Словарь темы

• In vitro / in vivo — «в пробирке» / «в живом организме».
• Эксплант — кусочек ткани или органа, вводимый в культуру.
• Каллус — неорганизованная масса дедифференцированных клеток.
• Дедифференцировка — утрата клеткой признаков специализации и возвращение к делению; редифференцировка — образование новых структур.
• Тотипотентность — способность клетки дать начало целому организму.
• Ауксины и цитокинины — фитогормоны; их соотношение определяет образование корней, побегов или каллуса.
• Среда Мурасиге и Скуга (MS) — стандартная питательная среда для культуры тканей растений.
• Пассирование — пересадка культуры на свежую среду.
• Клональное микроразмножение — получение в культуре множества генетически идентичных растений.
• Соматический эмбриогенез — образование зародышеподобных структур из соматических клеток; искусственные семена — такие зародыши в защитной капсуле.
• Протопласт — клетка без клеточной стенки; соматический гибрид — растение из слившихся протопластов разных видов; цибрид — растение с ядром одного родителя и цитоплазмой другого.
• Сомаклональная изменчивость — наследственные изменения, возникающие при культивировании клеток.
• Криоконсервация — хранение живого материала в жидком азоте при −196 °С; витрификация — переход воды в стеклообразное состояние без кристаллизации.
• Элиситор — вещество, имитирующее нападение патогена и усиливающее синтез защитных веществ в культуре.

21. Вирусы растений: почему с ними так трудно бороться

Чтобы понять ценность оздоровления, полезно знать, с чем именно борются.

Вирусы растений — это обычно молекула РНК (реже ДНК) в белковой оболочке. Сами они не могут ни проникнуть сквозь клеточную стенку, ни перелететь с растения на растение. Им нужны «ворота» и «транспорт»:

• Повреждение — вирус попадает в клетку через ранку: при обрезке, прививке, трении листьев, уходе за растениями. Вирус табачной мозаики так устойчив, что передаётся даже через руки и инструменты.
• Переносчики — чаще всего тли, а также цикадки, трипсы, белокрылки, клещи, нематоды, грибы. Тля прокалывает клетку хоботком, пробуя сок, и переносит вирус с заражённого растения на здоровое за секунды.
• Вегетативное размножение — клубни, усы, черенки, прививки переносят вирус в полном объёме; это главный путь накопления инфекции в сортах.
• Семена и пыльца — у части вирусов.

Внутри растения вирус распространяется от клетки к клетке через плазмодесмы (для этого у него есть особые транспортные белки) и быстро — по флоэме, вместе с током растворов. Поэтому заражение одного листа довольно скоро становится заражением всего растения.

Лечить вирусное заболевание растения в поле нечем: препаратов, избирательно убивающих вирус в растении, нет. Остаются профилактика (здоровый материал, борьба с переносчиками, дезинфекция инструментов), устойчивые сорта и выбраковка больных растений. Вот почему получение безвирусного посадочного материала через культуру меристем оказалось таким важным: это единственный надёжный способ «начать заново» со здорового растения, сохранив сорт.

Главные вирусные болезни, с которыми борется оздоровление

Любопытный исторический пример: в Голландии XVII в. самые дорогие тюльпаны с пёстрыми «языками пламени» на лепестках были больны — пестролепестность вызывал вирус, переносимый тлёй. Цветоводы не знали причины и ценили эти луковицы дороже золота; сегодня вирусные сорта выбраковывают, а похожая пестролепестность у современных сортов имеет наследственную природу.

22. Как выглядит работа в культуре тканей

Чтобы тема не оставалась абстрактной, проследим один рабочий день лаборанта.

Утро, средоварня. Готовится среда: в мерную колбу отмеряются концентрированные растворы солей, витаминов, добавляется сахароза, устанавливается pH 5,6–5,8, вносится агар. Среда кипятится до растворения агара, разливается по сосудам, закрывается и ставится в автоклав на 20 минут при 121 °С. После остывания среда затвердевает.

День, ламинарный бокс. Поверхность стола протирается спиртом, включается поток стерильного воздуха. Инструменты стерилизуются в стерилизаторе или обжигаются. Из сосуда извлекается разросшийся «кустик» побегов, разделяется скальпелем на части с одной-двумя почками, каждая часть помещается в новый сосуд со средой. Сосуды подписываются: сорт, этап, дата. Один сосуд с пятью побегами за 4 недели превратится в пять сосудов по пять побегов.

Культуральная комната. Сосуды расставляются на стеллажах под лампами; таймер включает свет на 16 часов в сутки, кондиционер держит 24 °С.

Контроль. Через несколько дней видно, появилась ли инфекция: мутная среда или пятно плесени означают, что сосуд надо удалить, не вскрывая в боксе. Раз в несколько пассажей часть растений проверяется на вирусы, а образцы сверяются с описанием сорта.

Адаптация. Укоренённые растения вынимаются из сосудов, корни отмываются от агара (иначе на нём разовьётся плесень), растения высаживаются в стерильный торфяной субстрат в кассеты и помещаются под плёнку или туман. Через 2–3 недели плёнка постепенно снимается.

23. Что происходит в клетке при переходе в культуру

Перенос кусочка ткани на среду — сильнейший стресс. Полезно понимать, что при этом происходит, — многие приёмы культивирования становятся очевидными.

• Ранение. На срезе разрушаются клетки, высвобождаются ферменты и фенольные вещества. Фенолы окисляются до тёмных соединений, ядовитых для соседних клеток, — отсюда побурение экспланта. Клетки, пережившие ранение, выделяют сигнальные вещества, запускающие деление, — тот же механизм, что заживляет рану в природе.
• Потеря связей. В целом растении клетка получает сигналы от соседей и гормоны из других органов. В культуре этих сигналов нет, и её поведение определяет только среда. Отсюда ключевая роль гормонов в пробирке.
• Дедифференцировка. Клетка перестраивает работу генов: включаются гены деления, выключаются гены специализации. Перестраивается упаковка хроматина, меняется форма ядра и размеры вакуоли.
• Переход на гетеротрофное питание. Хлоропласты в каллусе часто теряют хлорофилл и превращаются в бесцветные пластиды; клетка живёт на сахарозе среды.
• Нарушения деления. В стрессовых условиях чаще случаются ошибки митоза — отсюда полиплоидные и анеуплоидные клетки, то есть сомаклональная изменчивость.

Любопытно, что растению «знакомо» и образование каллуса, и регенерация побегов из корня, и укоренение черенка — культура тканей лишь воспроизводит в пробирке природные способности, которыми растения пользуются после повреждений.

24. Что дальше

• Фотоавтотрофное выращивание и биореакторы — снижение себестоимости пробирочного растения, отказ от сахара в среде и от части пересадок.
• Искусственные семена — соматические зародыши в капсулах, которые можно хранить и высевать машинами.
• Регенерация «трудных» видов. Многие важные культуры и древесные породы до сих пор плохо регенерируют в культуре. Выяснение генов, управляющих дедифференцировкой и образованием побегов, позволяет «включать» регенерацию прицельно.
• Редактирование генома без чужой ДНК — через протопласты, с последующей регенерацией растений.
• Культуры клеток как источник пищи. Изучается получение в культуре клеток какао, кофе, ванили — чтобы сократить вырубку лесов под плантации.
• Автоматизация и машинное зрение — главный резерв удешевления массового микроразмножения.

Все эти направления опираются на то же свойство, которое сто лет назад предположил Готлиб Габерландт и которое доказал опытом Фредерик Стюард, — на тотипотентность растительной клетки.

25. Выбор экспланта: почему он так важен

Успех культуры наполовину определяется тем, какой кусочек растения взят и когда.

Общие правила: чем моложе ткань, тем выше её способность к делению и регенерации; материал лучше брать весной или в начале роста, когда растение активно; донорское растение должно быть здоровым и подтверждённого сорта; чем меньше эксплант, тем он чище от инфекции, но тем труднее ему выжить — приходится искать равновесие.

Важна и полярность: фрагмент стебля «помнит», где у него был верх, и корни закладываются на морфологически нижнем конце, а побеги — на верхнем. Поэтому экспланты сажают в среду правильной стороной.

26. Способы размножения растений: где место культуры тканей

Видно, что культура тканей не заменяет другие способы, а дополняет их: она выигрывает там, где нужен быстрый старт чистого материала, а дальше его размножают обычными приёмами — клубнями, усами, черенками.

27. Экономика питомника: когда культура тканей окупается

Решение, размножать ли культуру в пробирке, принимают, сравнивая затраты и выгоды.

Затраты складываются из стоимости среды и посуды, электроэнергии (освещение и кондиционирование культуральной комнаты работают круглосуточно), оплаты труда (пересадка — ручная операция), потерь на всех этапах и затрат на проверку материала. Себестоимость одного пробирочного растения обычно в несколько раз выше, чем черенка.

Выгоды проявляются по-разному:

• у картофеля — через урожайность: оздоровленный материал окупает себя уже на второй-третий год размножения;
• у земляники и ягодных — через здоровье и силу рассады, то есть через урожай и долговечность плантации;
• у декоративных — через возможность быстро вывести на рынок новый сорт в больших количествах, пока он в моде;
• у плодовых подвоев — через однородность насаждений;
• у банана, финиковой пальмы, орхидей — просто потому, что иначе их не размножить в нужных объёмах.

Общее правило такое: чем дороже конечное растение, чем сильнее вирусы вредят культуре и чем хуже она размножается обычными способами, тем выгоднее культура тканей. Для дешёвых однолетних культур, которые прекрасно размножаются семенами, она не нужна.

Почему нельзя бесконечно размножать один клон

Кроме сомаклональной изменчивости есть ещё две причины ограничивать число циклов.

• Старение культуры. После многих пассажей побеги мельчают, хуже укореняются, растения труднее проходят адаптацию. Поэтому линии периодически обновляют, закладывая их заново из донорского растения.
• Фенотипические последствия. Длительное размножение на цитокинине усиливает ветвление и подавляет образование корней; у некоторых культур это сказывается и на высаженных в поле растениях — они дольше остаются «кустистыми».

Поэтому в технологических регламентах прямо указывают предельное число пассажей для каждой культуры: обычно от 6–8 до 12–15.

28. Итог: что важно знать

• Культура клеток и тканей — выращивание изолированных клеток, тканей или органов на искусственной среде в стерильных условиях (in vitro).
• Тотипотентность клеток растений — способность дать начало целому организму; доказана опытами Стюарда с культурой клеток моркови.
• Каллус — неорганизованная масса делящихся клеток; образуется при дедифференцировке.
• Развитие в культуре определяется соотношением ауксинов и цитокининов: больше цитокининов — побеги, больше ауксинов — корни, примерно поровну — каллус.
• Стандартная среда — Мурасиге и Скуга: минеральные соли, сахароза, витамины, фитогормоны, агар.
• Микроклональное размножение — получение множества генетически одинаковых растений; этапы: введение в культуру, размножение, укоренение, адаптация.
• Оздоровление от вирусов — выращивание растений из апикальной меристемы (часто с термотерапией) и обязательная проверка на вирусы.
• Протопласты — клетки без стенки, полученные обработкой целлюлазой и пектиназой; их слияние даёт соматические гибриды видов, которые не скрещиваются.
• Культура пыльников даёт гаплоиды; после удвоения числа хромосом — чистые линии за один цикл.
• В культуре клеток производят ценные вещества (шиконин, паклитаксел), сохраняют генетические ресурсы (пробирочные коллекции, криоконсервация), ведут клеточную селекцию и получают трансгенные растения.

29. Частые ошибки

• «Культура тканей — это выращивание растений в теплице». Это выращивание изолированных клеток и тканей на искусственной среде в стерильных сосудах.
• «Каллус — это орган растения». Каллус — неорганизованная масса слабо специализированных клеток, органов и тканей в нём нет.
• «Клетки в культуре питаются за счёт фотосинтеза». Основной источник углерода и энергии — сахароза среды; освещение нужно для развития, но фотосинтез не обеспечивает рост.
• «Микроклональное размножение даёт новые сорта». Оно даёт клоны — копии исходного растения; новые формы могут возникать лишь случайно, как сомаклональная изменчивость.
• «Меристемная культура убивает вирусы». Она не уничтожает вирусы, а позволяет получить растение из клеток верхушки, где вирусных частиц мало или нет; результат обязательно проверяют анализом.
• «Оздоровленное растение больше никогда не заболеет». Оно свободно от вирусов в момент получения, но может заразиться снова — через тлю, механически, с инструментом; поэтому его выращивают в защищённых условиях и ограничивают число репродукций.
• «Протопласт — это ядро клетки». Протопласт — вся клетка без клеточной стенки.
• «Соматические гибриды широко используют в сельском хозяйстве». «Помато» остался опытом; практическое значение имеет передача отдельных признаков (устойчивости, ЦМС) от диких родичей.
• «Гаплоиды используют как сорта». Гаплоиды стерильны и слабы; сортом может стать удвоенный гаплоид — гомозиготная линия.
• «Клетки в культуре всегда генетически одинаковы». При длительном культивировании накапливается сомаклональная изменчивость: меняется число хромосом, возникают мутации.

30. Интересные факты

• Культура ткани моркови, начатая Роже Готре в 1930-х гг., поддерживалась пересевами несколько десятилетий — дольше, чем живёт само растение.
• Массовое размножение орхидей в культуре превратило их из предмета роскоши в обычный комнатный цветок: до этого орхидеи размножали семенами, которые в природе прорастают только в симбиозе с грибом.
• Почти все бананы в мировой торговле — клоны одного сорта, размножаемые вегетативно, в основном в культуре тканей. Генетическое однообразие делает их уязвимыми: предыдущий основной сорт был практически уничтожен грибной болезнью в середине XX в., а нынешний теперь поражается новой расой того же гриба.
• Кокосовое молоко — жидкий эндосперм кокоса — оказалось в первых успешных средах не случайно: эндосперм питает зародыш и содержит природные цитокинины.
• Фермент целлюлаза, которым снимают клеточные стенки, получают из гриба триходермы — того же, что даёт целлюлазы для текстильной промышленности.
• Паклитаксел сначала выделяли из коры тихоокеанского тиса: на один курс лечения требовалось несколько взрослых деревьев. Культура клеток и полусинтез из возобновляемого сырья сняли эту проблему.
• Искусственные семена — соматические зародыши, заключённые в капсулу из геля с питательными веществами, — уже применяются для некоторых культур; их можно высевать обычными сеялками.
• В пробирочной коллекции на полке площадью с письменный стол помещается несколько сотен сортов картофеля — в поле для этого потребовались бы гектары.
• Габерландт в 1902 г. был прав в идее, но не мог добиться успеха: фитогормоны открыли только через 30 лет. Его работу считают началом культуры тканей растений.
• Самое массовое пробирочное растение в мире — картофель: счёт идёт на сотни миллионов микрорастений и мини-клубней ежегодно.
• Агар, без которого немыслима культура тканей, добывают из красных водорослей; тот же материал используют в микробиологии и в кулинарии как желирующее вещество.

31. Частые вопросы

Почему из клетки растения можно вырастить растение, а из клетки человека — нет?

Клетки растений сохраняют тотипотентность: при подходящем соотношении фитогормонов они дедифференцируются и способны образовать все органы. У животных специализированные клетки такую способность утратили: программы развития в них «закрыты» устойчивыми изменениями в упаковке хроматина. Получить организм из ядра соматической клетки животного можно только перенеся его в яйцеклетку, цитоплазма которой перепрограммирует ядро.

Зачем в среду добавляют сахарозу, если растения — автотрофы?

В пробирке мало света и углекислого газа, а ткани часто вовсе не зелёные (каллус, корни). Фотосинтез не покрывает потребности, поэтому клетки живут гетеротрофно за счёт сахарозы среды. Исключение — специальные установки с повышенным содержанием CO₂ и ярким светом, где растения в культуре переводят на самостоятельное питание.

Почему меристема свободна от вирусов?

В апикальной меристеме нет проводящих пучков, по которым вирус быстро распространяется, клетки делятся очень быстро, а передача вируса через плазмодесмы отстаёт от роста. Кроме того, в меристеме активны механизмы защиты, подавляющие размножение вирусов. Полной гарантии нет, поэтому каждое растение проверяют.

Чем микроклональное размножение лучше черенкования?

Скоростью (коэффициент размножения в десятки раз выше), стерильностью (материал свободен от вирусов и других возбудителей), круглогодичностью и компактностью. Недостатки — дороговизна, необходимость лаборатории и квалификации, риск сомаклональной изменчивости при размножении через каллус.

Почему адаптация — самый сложный этап?

В пробирке растение живёт при влажности, близкой к 100 %, получает готовый сахар, у него недоразвиты устьица и кутикула, слабая механическая ткань. При переносе в обычные условия оно легко теряет воду и может погибнуть. Поэтому влажность снижают постепенно, растения притеняют и подкармливают, пока не разовьётся нормальный лист.

Что такое сомаклональная изменчивость и откуда она берётся?

Это наследственные изменения, возникающие у растений, выращенных через культуру клеток: изменения числа хромосом, перестройки, мутации, активация подвижных элементов генома. Причина — стресс культивирования и нарушение нормального контроля деления. Для размножения сорта это помеха, для селекции — дополнительный источник разнообразия.

Зачем нужны протопласты, если ген можно ввести агробактерией?

Агробактерия хорошо заражает двудольные растения, но плохо — многие однодольные (злаки); кроме того, через протопласты проводят слияние клеток, которое агробактерией невозможно. Сегодня для злаков чаще используют другие способы доставки ДНК, но протопласты остаются удобным объектом, в том числе для редактирования генома без встраивания чужой ДНК.

Можно ли вырастить в культуре целый плод или клубень?

Да, в культуре получают микроклубни картофеля — маленькие клубни на пробирочных растениях при высоком содержании сахарозы и подходящем режиме освещения. Они удобны для хранения и перевозки семенного материала. Полноценные плоды в культуре обычно не выращивают — это невыгодно.

Можно ли вырастить растение из клетки корня или лепестка?

Как правило, да, если клетка живая и не слишком специализирована. Проще всего каллус образуют ткани с живой паренхимой: сердцевина стебля, черешок, молодой лист, корнеплод, зародыш, завязь. Труднее — сильно одревесневшие ткани и клетки, утратившие ядро (сосуды, ситовидные трубки): они вообще не способны делиться.

Почему среду делают слабокислой (pH 5,6–5,8)?

При таком pH агар нормально застывает, минеральные вещества остаются доступными и не выпадают в осадок, а клетки растений чувствуют себя привычно: кислотность апопласта у растений как раз слабокислая. При pH выше 6 железо и фосфаты осаждаются, при pH ниже 5 агар плохо твердеет.

Правда ли, что все растения одного клона абсолютно одинаковы?

Генетически они практически идентичны, но внешне могут различаться: на облик влияют условия выращивания, возраст донорского растения, место побега в исходном растении. Кроме того, при длительном культивировании возможна сомаклональная изменчивость, поэтому за соответствием сорту следят отдельно.

32. ЕГЭ

Тема относится к элементу 3.7 кодификатора [1]: «Объекты, используемые в биотехнологии, – клеточные и тканевые культуры, микроорганизмы, их характеристика». Она связана также с элементами о тканях растений, о бесполом и вегетативном размножении и о методах селекции.

Что обязательно знать

• Определения: культура клеток и тканей, каллус, тотипотентность, протопласт, клональное микроразмножение.
• Состав среды и роль фитогормонов (ауксины — корни, цитокинины — побеги).
• Суть и этапы микроклонального размножения; его преимущества.
• Метод оздоровления от вирусов через апикальную меристему и его объяснение.
• Соматическая гибридизация: как получают протопласты, зачем их сливают.
• Получение гаплоидов из пыльников и значение удвоенных гаплоидов.
• Отличия культур растительных и животных клеток.

Разбор типичных формулировок

«Установите соответствие между методом и его результатом». Культура меристем — безвирусный посадочный материал; слияние протопластов — соматический гибрид; культура пыльников — гаплоиды; микроклональное размножение — клоны исходного растения; культура зародышей — спасение гибридов при отдалённой гибридизации.

«Выберите три верных утверждения о культуре тканей растений». Верные: клетки растений тотипотентны; каллус — неорганизованная масса клеток; в среду добавляют фитогормоны и сахарозу; из каллуса можно получить целое растение. Ловушки: «клетки питаются только фотосинтезом», «культура тканей позволяет получить новый вид», «в культуре клетки всегда генетически идентичны».

Часть 2: «В чём преимущества клонального микроразмножения перед обычным вегетативным?» Элементы ответа: 1) высокий коэффициент размножения — из одного растения за год тысячи потомков; 2) посадочный материал свободен от вирусов и других возбудителей; 3) размножение идёт круглый год и занимает мало места; 4) все растения генетически идентичны исходному и сохраняют свойства сорта.

Часть 2: «Почему растения, полученные из верхушечной меристемы, не содержат вирусов?» Элементы: 1) в меристеме нет проводящих пучков, по которым распространяется вирус; 2) клетки делятся быстрее, чем размножается и передаётся вирус; 3) поэтому в верхушке вирусных частиц мало или нет; 4) полученные растения проверяют анализом.

33. Для олимпиад

Коэффициент размножения: геометрическая прогрессия

Пусть за один цикл (4 недели) каждый побег даёт 5 новых. Сколько растений получится за год? Циклов в году 52/4 = 13; число растений 5¹³ ≈ 1,2 · 10⁹. Такого количества, конечно, не производят: ограничивают площадь лаборатории и потребность рынка, а часть материала теряется. Но расчёт показывает, почему культура тканей так быстро меняет семеноводство: даже при коэффициенте 3 за год получается 3¹³ ≈ 1,6 млн растений.

Обратная задача. Сколько циклов нужно, чтобы из одного побега получить 100 000 растений при коэффициенте 4? 4ⁿ = 10⁵; n = 5·lg10/lg4 ≈ 5/0,602 ≈ 8,3, то есть 9 циклов — примерно 8–9 месяцев.

Осмотика протопластов

Снимая клеточную стенку, мы лишаем клетку опоры, уравновешивавшей тургорное давление. В гипотоническом растворе вода пойдёт внутрь, и протопласт лопнет. Поэтому ферментную смесь и среду делают гипертоническими — добавляют маннит (обычно 0,4–0,7 моль/л). Оценим осмотическое давление 0,5 моль/л маннита при 25 °С: π = cRT = 0,5 · 8,31 · 298 ≈ 1238 кПа ≈ 12 атм. Это сопоставимо с осмотическим давлением клеточного сока — именно то, что нужно для равновесия.

Почему оздоровление повышает урожай

Вирус не убивает растение, но отнимает у него ресурсы и нарушает фотосинтез. Если заражённое растение даёт 70 % урожая здорового, а в хозяйстве заражено 80 % посадок, то средний урожай составит 0,2 · 100 % + 0,8 · 70 % = 76 % от потенциального. Переход на оздоровленный материал поднимает его к 100 %, то есть урожай вырастает в 100/76 ≈ 1,3 раза — почти на треть, без каких-либо изменений в агротехнике.

Гаплоиды и скорость селекции

При обычном самоопылении доля гомозиготных по одному гену растений в поколениях равна 1 − (1/2)ⁿ: после 6 поколений — 98,4 %, но по 10 генам одновременно — лишь (1 − 1/64)¹⁰ ≈ 0,85. Удвоенный гаплоид гомозиготен по всем генам сразу и получается за один цикл. Отсюда выигрыш в 4–6 лет на сорт.

Соотношение гормонов: почему именно оно

Ауксины и цитокинины действуют на одни и те же процессы, но с противоположным «уклоном»: ауксин усиливает заложение корней и подавляет боковые почки (апикальное доминирование), цитокинин снимает апикальное доминирование и запускает развитие побегов. В целом растении ауксин синтезируется в верхушке побега и движется вниз, цитокинины образуются в корнях и движутся вверх; градиент этих гормонов и определяет, где растут корни, а где побеги. Культура тканей просто воспроизводит этот природный механизм в пробирке.

Задача на понимание

Исследователь получил каллус из листа картофеля и вырастил из него 200 растений. Проверка показала, что 12 из них отличаются по числу хромосом, а 3 — по устойчивости к засолению. Какие явления он наблюдал и как это можно использовать? Ответ: сомаклональная изменчивость; растения с изменённым числом хромосом для размножения сорта непригодны, а устойчивые к засолению формы стоит проверить в потомстве — если признак наследуется, их можно использовать в селекции.

34. Задания с разбором

Задание 1

Что такое тотипотентность? Почему она свойственна клеткам растений и не свойственна специализированным клеткам животных?

Задание 2

Что такое каллус и как его получают?

Задание 3

Как изменится развитие культуры, если в среде повысить содержание цитокининов? ауксинов?

Задание 4

Назовите четыре этапа клонального микроразмножения.

Задание 5

Почему растения, выращенные из апикальной меристемы, обычно свободны от вирусов?

Задание 6

Что такое протопласт и как его получают?

Задание 7

Зачем сливают протопласты разных видов? Приведите пример.

Задание 8

Что получают из культуры пыльников и зачем?

Задание 9

Найдите ошибки и исправьте: 1) В культуре клетки растений питаются за счёт фотосинтеза. 2) Каллус — ткань, состоящая из специализированных клеток. 3) Среда Мурасиге и Скуга содержит минеральные соли, сахарозу, витамины и фитогормоны. 4) Микроклональное размножение даёт генетически разнообразные растения. 5) Протопласты получают с помощью целлюлазы и пектиназы.

Задание 10

Почему адаптация пробирочных растений к обычным условиям требует особой осторожности?

Задание 11

Что такое сомаклональная изменчивость? В каком случае это недостаток, а в каком — достоинство?

Задание 12

Какие преимущества даёт выращивание ценных веществ в культуре клеток растений по сравнению со сбором сырья?

Задание 13

Установите соответствие между методом и результатом: А) культура меристем; Б) слияние протопластов; В) культура пыльников; Г) культура зародышей; Д) клеточная селекция. Результат: 1) гаплоиды; 2) безвирусные растения; 3) соматический гибрид; 4) растения, устойчивые к засолению; 5) гибрид от скрещивания далёких видов.

Задание 14

Зачем в культуре тканей используют стерильные условия?

Задание 15

Чем культура клеток растений отличается от культуры клеток животных? Назовите не менее трёх отличий.

Задание 16

Как сохраняют сорта растений, которые нельзя хранить семенами?

Задание 17

Почему культура тканей необходима для получения трансгенных растений?

Задание 18

Объясните, почему микроклубни картофеля удобны для семеноводства.

Задание 19 (олимпиадное)

Коэффициент размножения в культуре равен 4 за цикл в 5 недель. Сколько растений получится из одного экспланта за 10 месяцев? Сколько циклов нужно, чтобы получить миллион растений? Какие ограничения не позволяют достичь теоретических чисел?

Задание 20 (олимпиадное)

Для выделения протопластов используют раствор маннита 0,6 моль/л. Оцените его осмотическое давление при 25 °С и объясните, зачем оно нужно. Что произойдёт, если по ошибке взять дистиллированную воду?

Литература

1. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.
2. Steward F. C., Mapes M. O., Smith J. Growth and organized development of cultured cells. III. Interpretations of the growth from free cell to carrot plant // American Journal of Botany. 1958. Vol. 45, № 10. P. 709–713. DOI: 10.1002/j.1537-2197.1958.tb10600.x.
3. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15, № 3. P. 473–497. DOI: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.
4. Nagata T., Takebe I. Cell wall regeneration and cell division in isolated tobacco mesophyll protoplasts // Planta. 1970. Vol. 92, № 4. P. 301–308. DOI: 10.1007/bf00385097.
5. Takebe I., Labib G., Melchers G. Regeneration of whole plants from isolated mesophyll protoplasts of tobacco // Die Naturwissenschaften. 1971. Vol. 58, № 6. P. 318–320. DOI: 10.1007/bf00624737.