Регуляция клеточного цикла: контрольные точки, циклины, p53 и рак

Летом 1982 года британский биохимик Тимоти Хант работал на морской биологической станции в Вудс-Холе с оплодотворёнными яйцами морских ежей. Он метил белки радиоактивной аминокислотой и каждые десять минут брал пробы, чтобы посмотреть, какие белки синтезируются при дроблении. Почти все белки накапливались постепенно. Но один вёл себя странно: его становилось всё больше перед каждым делением, а во время деления он внезапно исчезал — и снова начинал накапливаться [1]. Хант назвал этот белок циклином — отчасти за циклическое поведение, отчасти, как он потом шутил, потому что сам любил кататься на велосипеде. Так был найден один из главных «моторов» клеточного цикла, а через девятнадцать лет Хант получил за это Нобелевскую премию.

Это восьмая статья серии о клеточном цикле и делении клетки (начало — «Клеточный цикл и интерфаза»). В ней разобрано, как клетка управляет переходами между периодами цикла, что такое контрольные точки, циклины, циклин-зависимые киназы и белок p53, и почему нарушение этой системы приводит к раку.

• 1. Два принципа управления циклом
• 2. Как нашли «двигатель» цикла
• 3. Циклины и циклин-зависимые киназы
• 4. Разрушение белков: цикл идёт только вперёд
• 5. Точка рестрикции: решение делиться
• 6. Контрольные точки цикла
• 7. Белок p53 — «страж генома»
• 8. Рак — болезнь клеточного цикла
• 9. Причины рака и его профилактика
• 10. Как лечат рак, воздействуя на цикл
• 11. Итог: как устроена регуляция цикла
• 12. Частые ошибки
• 13. Интересные факты
• 14. Частые вопросы
• 15. ЕГЭ
• 16. Для олимпиад
• 17. Задания с разбором
• Литература

1. Два принципа управления циклом

Клеточный цикл — строго упорядоченная последовательность событий. ДНК должна удвоиться до митоза, и удвоиться ровно один раз. Хромосомы нельзя разделять, пока они не прикреплены к веретену. Клетка не должна делиться, если её ДНК повреждена. Чтобы всё это соблюдалось, у клетки есть система управления, построенная на двух принципах.

• «Двигатель». Переходы между периодами запускают несколько белковых комплексов — циклинов с циклин-зависимыми киназами. Их активность нарастает и падает в определённом порядке, как будто стрелка часов последовательно включает события цикла.
• «Тормоза». Перед каждым ключевым переходом стоит контрольная точка, которая проверяет, выполнены ли предыдущие этапы. Если нет, «двигатель» останавливается, пока ошибка не будет исправлена.

Это похоже на конвейер с контролёрами: детали движутся по порядку, а на важнейших участках стоят проверяющие, которые могут остановить ленту. Слово «контрольная точка» ввели в 1989 году Лиланд Хартвелл и Тед Вайнерт, обобщив опыты с мутантами дрожжей: у мутантов без определённых проверок клетки делились, не дождавшись окончания репликации или ремонта ДНК, и погибали [2].

2. Как нашли «двигатель» цикла

Открытие механизма управления циклом — пример того, как три независимых направления исследований сошлись в одной точке.

В 1987 году Нерс и его сотрудница Мелани Ли сделали решающий шаг. Они взяли дрожжи с повреждённым геном циклин-зависимой киназы, которые не могли делиться, и вводили в них по очереди фрагменты ДНК человека. Один из фрагментов вернул дрожжам способность делиться [3]. Ген человека заменил ген дрожжей, хотя их общий предок жил больше миллиарда лет назад. Вскоре выяснилось, что фактор, запускающий деление лягушачьих ооцитов, — это и есть комплекс циклина с этой киназой. Три направления сошлись: у всех эукариот цикл управляется одним и тем же механизмом. В 2001 году Хартвелл, Нерс и Хант получили Нобелевскую премию.

3. Циклины и циклин-зависимые киназы

Главные участники «двигателя» — два типа белков. Циклин-зависимые киназы, или CDK (от англ. cyclin-dependent kinase), — ферменты, которые переносят фосфатную группу с АТФ на определённые белки-мишени. Присоединение фосфата меняет форму и активность белка: одни белки после этого включаются, другие выключаются, третьи отправляются на разрушение. Сама по себе киназа неактивна: её активный центр закрыт. Он открывается, только когда к киназе присоединяется циклин. Циклин — это одновременно «ключ зажигания» и «навигатор»: он не только включает киназу, но и указывает, какие белки ей фосфорилировать.

Количество киназ в клетке почти постоянно, а количество циклинов меняется. Каждый циклин синтезируется в свой период цикла и разрушается, когда его работа сделана. Поэтому активность каждого комплекса нарастает и падает в определённый момент — и цикл идёт вперёд.

У человека известно около двадцати циклин-зависимых киназ и столько же циклинов, но для клеточного цикла важны именно перечисленные. У дрожжей всё ещё проще: одна-единственная киназа работает на всех этапах, меняя циклины-«навигаторы». В 2010 году Нерс и его сотрудник Дамьен Кудрёз показали, что дрожжи, у которых оставлен один слитый белок «циклин + киназа», могут пройти весь цикл [4]: разные события запускаются просто разными уровнями активности. Низкая активность достаточна для начала репликации, высокая — для вхождения в митоз.

Фактор, запускающий митоз

В 1971 году Ёсио Масуи и Клемент Маркерт изучали ооциты лягушки. Ооцит долго стоит перед первым делением мейоза, а под действием гормона прогестерона созревает и вступает в деление. Учёные взяли немного цитоплазмы созревающего ооцита и ввели её в незрелый ооцит, не обработанный гормоном. Незрелый ооцит тоже начал делиться. Значит, в цитоплазме есть вещество, которое само по себе запускает деление [5]. Его назвали фактором созревания, а позже — фактором, способствующим митозу (MPF). Через семнадцать лет удалось выделить его в чистом виде: это оказался комплекс циклина B с киназой CDK1.

Похожий опыт можно поставить и с клетками в культуре. Если слить клетку, находящуюся в митозе, с клеткой в интерфазе, хромосомы интерфазной клетки тут же начинают конденсироваться — даже если ДНК ещё не удвоена. Хромосомы ядра из G₁ выглядят как тонкие одиночные нити, из G₂ — как двойные, а из S-периода — как «распылённые» обрывки. Этот метод, преждевременная конденсация хромосом, позволяет увидеть хромосомы клетки, которая сама не делится.

Как клетка «знает» свой размер

Клетка должна делиться, только достигнув определённого размера: иначе с каждым делением дочерние клетки становились бы всё мельче. Пол Нерс нашёл мутантов делящихся дрожжей, которые вступали в митоз раньше времени и были вдвое меньше нормальных. Он назвал их wee — шотландским словом, означающим «крошечный». Ген wee1 кодирует ту самую киназу, которая ставит на CDK1 «запрещающий» фосфат. Чем крупнее клетка, тем больше в ней активирующей фосфатазы по сравнению с тормозящей киназой, и когда соотношение сдвигается в пользу фосфатазы, клетка вступает в митоз. Так размер клетки переводится на язык белков. У животных похожий контроль работает в G₁: мелкие дочерние клетки дольше остаются в G₁ и успевают дорасти.

Как включается и выключается киназа

Присоединения циклина недостаточно: активность киназы регулирует ещё несколько механизмов. Их полезно знать хотя бы в общих чертах, потому что каждый из них — «рычаг», на который нажимают контрольные точки.

1. Синтез и разрушение циклина. Нет циклина — нет активности. Это главный способ.
2. Тормозящее фосфорилирование. Особые киназы присоединяют к CDK1 «запрещающие» фосфаты, и комплекс с циклином B накапливается в неактивной форме. В нужный момент фермент-фосфатаза снимает эти фосфаты, и весь накопленный запас включается разом. Поэтому вход в митоз — резкий, почти мгновенный переход.
3. Белки-ингибиторы. Небольшие белки, например p21 и p27, присоединяются к комплексу циклин–киназа и блокируют его. Именно через ингибиторы чаще всего работает «стоп-сигнал» при повреждениях ДНК.
4. Положение в клетке. Комплекс циклина B с CDK1 до поры выводится из ядра в цитоплазму и только перед митозом резко накапливается в ядре.

Включение CDK1 устроено как положительная обратная связь: активный комплекс включает фосфатазу, которая активирует ещё больше комплексов, а сам он при этом выключает тормозящие киназы. Достаточно небольшого толчка, чтобы процесс лавинообразно дошёл до конца. Поэтому клетка не может «войти в митоз наполовину»: переход работает как выключатель, у которого есть только два положения.

4. Разрушение белков: цикл идёт только вперёд

Почему клеточный цикл нельзя прокрутить назад? Потому что ключевые переходы связаны с разрушением белков, а разрушенный белок нельзя «собрать обратно». Клетка разрушает белки с помощью небольшого белка убиквитина. Специальные ферменты пришивают к белку-мишени цепочку из нескольких молекул убиквитина, и такой «помеченный» белок узнаёт и расщепляет протеасома — большая белковая «мясорубка» в цитоплазме и ядре.

В клеточном цикле работают два главных комплекса, помечающих белки убиквитином. Первый действует на переходе G₁/S и разрушает ингибиторы киназ, освобождая путь к репликации. Второй, комплекс, стимулирующий анафазу (APC/C), работает в митозе. Он метит два белка:

• секурин — белок, удерживающий фермент сепаразу. Когда секурин разрушен, сепараза разрезает когезин, скрепляющий сестринские хроматиды, и начинается анафаза;
• циклин B — после его разрушения CDK1 выключается, и клетка выходит из митоза: восстанавливается ядерная оболочка, хромосомы деконденсируются, идёт цитокинез.

Это объясняет загадку, с которой начал Хант: циклин исчезал сразу после деления, потому что его разрушал APC/C. Если ввести в клетку изменённый циклин B, который не может быть помечен убиквитином, клетка входит в митоз, разделяет хроматиды, но не может выйти из митоза: хромосомы остаются конденсированными, ядро не восстанавливается. Опыты с такими «неразрушаемыми» циклинами в вытяжках из яиц лягушки, поставленные в 1989 году, доказали, что разрушение циклина — необходимый шаг выхода из митоза. За открытие системы убиквитинового разрушения белков Аарон Чехановер, Аврам Гершко и Ирвин Роуз получили Нобелевскую премию по химии 2004 года.

5. Точка рестрикции: решение делиться

Главное решение в жизни клетки — делиться или нет — принимается в G₁. В конце этого периода есть момент, после которого клетка уже не может остановиться и обязательно пройдёт весь цикл, даже если внешние сигналы исчезнут. Его называют точкой рестрикции (у дрожжей — «стартом»). Точку рестрикции открыл в 1974 году американский биолог Артур Парди, выращивая клетки в среде с недостатком сыворотки: клетки, не дошедшие до определённого момента G₁, останавливались, а прошедшие его — завершали деление [6].

До точки рестрикции клетка «слушает» окружение. Делиться её побуждают факторы роста — белки, которые выделяют соседние клетки или приносит кровь. Например, тромбоциты в месте раны выделяют фактор роста, стимулирующий деление клеток соединительной ткани, и рана затягивается. Фактор роста связывается с рецептором на мембране, и по цепочке белков сигнал передаётся в ядро. Там включаются гены, и в клетке начинает синтезироваться циклин D. Если факторов роста нет, циклин D не образуется, и клетка выходит из цикла в состояние покоя G₀.

Белок Rb и фактор E2F

Ключ к точке рестрикции — белок Rb (от англ. retinoblastoma — по названию опухоли сетчатки, при которой ген этого белка был найден). Rb работает как «предохранитель». Он связывает белок E2F — фактор транскрипции, который включает гены, нужные для S-периода: циклина E, ферментов синтеза нуклеотидов, ДНК-полимеразы. Пока E2F связан с Rb, эти гены молчат.

1. Под действием факторов роста синтезируется циклин D. Он соединяется с CDK4 или CDK6, и комплекс начинает фосфорилировать Rb.
2. Частично фосфорилированный Rb слабее держит E2F. Освобождённая часть E2F включает ген циклина E.
3. Комплекс циклина E с CDK2 фосфорилирует Rb ещё сильнее, освобождая ещё больше E2F, который синтезирует ещё больше циклина E. Возникает положительная обратная связь.
4. Когда Rb фосфорилирован полностью, весь E2F свободен. Это и есть точка рестрикции: теперь процесс поддерживает сам себя, и внешние сигналы уже не нужны.

Если Rb отсутствует или не работает, E2F всегда свободен, и клетка вступает в S-период без всякого разрешения извне. Так ведёт себя клетка опухоли. Не случайно Rb был открыт как ген, отсутствие которого вызывает рак.

Сигналы «стоп»

Клетка получает не только сигналы «делись», но и сигналы «не делись». Нормальные клетки в культуре делятся, пока не покроют дно чашки сплошным слоем, а затем останавливаются: соприкосновение с соседями тормозит деление. Это контактное торможение. Клетки опухоли его теряют и громоздятся друг на друга. Тормозящие сигналы передают и некоторые белки межклеточной среды, например трансформирующий фактор роста β: он вызывает синтез ингибиторов киназ, которые блокируют комплексы циклина D и E.

Ещё одно условие деления — прикрепление. Большинство клеток животных делятся, только будучи прикреплены к опоре; клетка, висящая во взвеси, остаётся в G₁. Исключение составляют клетки крови. Клетки опухоли способны делиться и без прикрепления, и это помогает им давать метастазы.

Возвращение из G₀

Выход в G₀ не всегда окончателен. Клетки печени взрослого человека делятся очень редко, но если удалить до двух третей печени, оставшиеся клетки в течение одного-двух дней выходят из G₀, проходят точку рестрикции и делятся, пока масса органа не восстановится, — обычно за несколько недель. Затем они снова останавливаются. Сигналом служат факторы роста и цитокины, которые выделяются после повреждения. Эта способность позволяет пересаживать часть печени от живого донора: и у донора, и у больного печень дорастает до нормального размера. Древние греки, кажется, что-то подозревали: в мифе о Прометее орёл каждый день выклёвывал титану печень, а за ночь она отрастала заново.

Регуляция деления у растений

У растений те же циклины и киназы, но внешние сигналы другие. Деление клеток растений стимулируют фитогормоны: ауксины и цитокинины. Название «цитокинины» и означает «вызывающие цитокинез». Их открыли в 1950-х годах, когда Фолке Скуг и Карлос Миллер искали вещества, заставляющие делиться клетки табака в культуре: деление шло, только если в среде были и ауксин, и цитокинин. Соотношение этих гормонов определяет и судьбу клеток: при избытке ауксина из каллуса — массы делящихся клеток — образуются корни, при избытке цитокинина — побеги. На этом основано размножение растений культурой тканей. Деление у растений сосредоточено в меристемах, а клетки остальных тканей обычно находятся в G₀, хотя многие из них сохраняют способность снова начать делиться — например, при ранении.

6. Контрольные точки цикла

Контрольные точки — системы проверки, которые останавливают цикл, если что-то пошло не так. Каждая проверяет своё.

Контрольная точка веретена — самая «чувствительная»: один-единственный неприкреплённый кинетохор способен задержать анафазу. Это показали в 1995 году Конли Ридер и его коллеги: они следили под микроскопом за клетками, у которых одна хромосома запаздывала с прикреплением, и видели, что анафаза начиналась только через двадцать с лишним минут после того, как прикрепилась последняя хромосома [7]. А если лазером разрушить кинетохор последней неприкреплённой хромосомы, клетка вскоре вступает в анафазу, хотя хромосома так и не прикреплена. Подробнее о прикреплении хромосом рассказано в статье «Митоз».

Как клетка узнаёт о повреждениях ДНК

Повреждения ДНК — разрывы, изменённые основания, сшивки цепей — возникают постоянно. В каждой клетке человека за сутки появляются десятки тысяч однонитевых повреждений и несколько десятков двунитевых разрывов. Источники — свободные радикалы, образующиеся при дыхании, ультрафиолет, ионизирующее излучение, химические мутагены, ошибки репликации.

Повреждения узнают белки-«сенсоры». Две главные киназы-«сигнальщики» называются ATM и ATR. ATM включается при двунитевых разрывах, ATR — при однонитевых участках ДНК, которые возникают, например, когда останавливается репликационная вилка. Включившись, они фосфорилируют десятки белков, и сигнал расходится по трём направлениям:

• остановить цикл — через ингибиторы киназ и фосфатазы CDK;
• починить ДНК — к месту повреждения собираются ферменты репарации;
• если починить нельзя — уничтожить клетку или навсегда вывести её из цикла.

Остановка в G₂ устроена особенно изящно. Киназы ATM и ATR включают киназы-«посредники» Chk1 и Chk2, а те фосфорилируют фосфатазу, которая должна снять «запрещающие» фосфаты с CDK1. Помеченная фосфатаза выводится из ядра или разрушается. В итоге комплекс циклина B с CDK1 остаётся заторможенным, и клетка стоит в G₂ до тех пор, пока ДНК не починена. Этот механизм работает и без p53, поэтому опухолевые клетки, потерявшие p53, особенно зависят от остановки в G₂. На этом строятся новые подходы к лечению: если у такой клетки заблокировать ещё и Chk1, она войдёт в митоз с повреждённой ДНК и погибнет, а нормальные клетки, сохранившие p53, остановятся в G₁ и уцелеют.

Ген ATM получил название от болезни атаксия-телеангиэктазия: ATM — от англ. ataxia-telangiectasia mutated, «изменённый при атаксии-телеангиэктазии». У больных нарушена координация движений, на коже и глазах видны расширенные сосуды, клетки очень чувствительны к облучению, а риск опухолей, особенно лимфом, резко повышен. Болезнь хорошо показывает, что бывает, когда клетка не может «заметить» разрывы ДНК.

7. Белок p53 — «страж генома»

В 1979 году Дэвид Лейн и Лайонел Кроуфорд изучали клетки, заражённые вирусом SV40, который вызывает опухоли у грызунов. Они заметили, что белок вируса, большой T-антиген, прочно связан с каким-то белком самой клетки, который при разделении в геле вёл себя как белок массой около 53 тысяч дальтон [8]. Белок назвали p53 (от англ. protein — белок). Одновременно и независимо его нашли ещё несколько лабораторий. Десять лет p53 считали онкогеном — белком, который способствует раку, потому что в опухолях его было много. Только в 1989 году выяснилось, что в опытах использовали изменённый ген, а нормальный p53, наоборот, подавляет деление. Позже оказалось, что ген p53 — TP53 — изменён примерно в половине всех опухолей человека. Это самый частый «виновник» рака из известных. В 1992 году Лейн назвал p53 «стражем генома» [9], и это название закрепилось.

Как работает p53

В здоровой клетке p53 синтезируется постоянно, но почти сразу разрушается: белок MDM2 метит его убиквитином для протеасомы. Поэтому в нормальной клетке p53 мало, и он почти ничего не делает. При повреждении ДНК киназы ATM и ATR фосфорилируют p53 и MDM2, их связь нарушается, и p53 накапливается. Он работает как фактор транскрипции: связывается с ДНК и включает гены-мишени. Их известно несколько сотен, но главные эффекты сводятся к трём.

Важно, что p53 сам себя ограничивает: одна из его мишеней — ген MDM2. Чем больше p53, тем больше синтезируется MDM2, который его разрушает. Возникает отрицательная обратная связь, и когда повреждение устранено, уровень p53 быстро возвращается к норме. В отдельных клетках, облучённых ионизирующим излучением, количество p53 при этом колеблется волнами: пик, спад, снова пик — пока ДНК не будет починена.

Если p53 не работает, клетка с повреждённой ДНК не останавливается и не погибает, а продолжает делиться. Ошибки передаются потомкам, накапливаются новые, и в конце концов возникает опухоль. Поэтому p53 относят к генам-супрессорам опухолей. Как устроена сама программа гибели клетки, рассказано в статье «Апоптоз».

Синдром Ли — Фраумени

В 1969 году американские врачи Фредерик Ли и Джозеф Фраумени описали семьи, в которых у многих родственников, нередко уже в детстве, развивались самые разные опухоли: саркомы мягких тканей и костей, рак молочной железы, опухоли мозга, лейкозы. Только в 1990 году выяснилось, что в таких семьях передаётся по наследству одна изменённая копия гена TP53. Вторая копия нормальна, но в течение жизни в какой-нибудь клетке она тоже повреждается — и эта клетка теряет защиту. У носителей такой мутации риск рака в течение жизни очень высок, у женщин он приближается к 90 %.

Парадокс Пето: почему слоны редко болеют раком

Если каждое деление клетки — риск мутации, то крупные долгоживущие животные должны болеть раком гораздо чаще мелких: у слона клеток в несколько десятков раз больше, чем у человека, и живёт он столько же. Однако этого не происходит. Слоны, киты, человек болеют раком не чаще, а иногда и реже мышей. Это противоречие в 1977 году отметил британский эпидемиолог Ричард Пето, и его называют парадоксом Пето.

Частичный ответ нашли у слонов. У человека одна пара генов TP53, а у африканского слона — около двадцати копий этого гена; большинство из них — так называемые ретрогены, возникшие при встраивании в геном копий мРНК, но часть из них работает. Клетки слона в ответ на повреждение ДНК гораздо охотнее вступают в апоптоз, чем клетки человека [10]. Клетка, в которой повреждена ДНК, просто погибает, не успев стать опухолевой. По данным зоопарков, от рака умирает менее 5 % слонов, тогда как у людей — 11–25 % [11]. У голых землекопов, которые тоже почти не болеют раком, защита устроена иначе: их клетки очень рано прекращают делиться при контакте с соседями.

8. Рак — болезнь клеточного цикла

Опухоль — это разрастание клеток, вышедших из-под контроля систем, регулирующих деление. Доброкачественная опухоль растёт на месте, окружена капсулой и не прорастает в соседние ткани. Злокачественная опухоль (рак в широком смысле) прорастает в окружающие ткани и даёт метастазы — отсевы в другие органы, куда опухолевые клетки попадают с кровью или лимфой. Почти всегда опухоль происходит от одной клетки, в которой накопились изменения нескольких генов, управляющих циклом. Эти гены делятся на две группы.

Протоонкоген может превратиться в онкоген разными путями: точечной мутацией, которая делает белок постоянно активным (так часто изменяется ген RAS); умножением числа копий гена (амплификация HER2 при раке молочной железы); перестройкой хромосом, которая ставит ген под чужой сильный промотор или создаёт слитый белок.

Откуда взялись онкогены

В 1911 году американский патолог Фрэнсис Пейтон Раус измельчил опухоль-саркому курицы, пропустил вытяжку через фильтр, задерживающий клетки и бактерии, и ввёл её здоровым курам. У них тоже развивались саркомы. Значит, опухоль вызывал агент мельче бактерии — вирус. Открытию долго не верили, и Нобелевскую премию Раус получил только в 1966 году, через 55 лет, в возрасте 87 лет.

Позже выяснилось, что вирус саркомы Рауса — ретровирус и что за превращение клеток в опухолевые отвечает один его ген, src. В 1976 году Майкл Бишоп и Гарольд Вармус обнаружили, что ген, родственный src, есть в ДНК нормальных кур и других птиц, а позже его нашли и у человека [12]. Это был поразительный результат: «ген рака» оказался обычным геном клетки, который вирус когда-то «украл» и изменил. Нормальный ген стали называть протоонкогеном. Бишоп и Вармус получили Нобелевскую премию в 1989 году. Сейчас известно, что большинство опухолей человека вызваны не вирусами, а мутациями собственных протоонкогенов клетки.

Гипотеза двух ударов

Ретинобластома — злокачественная опухоль сетчатки, которой болеют маленькие дети. Бывает две формы болезни: наследственная, при которой опухоли часто возникают в обоих глазах и в раннем возрасте, и спорадическая, при которой поражается один глаз и позднее. В 1971 году американский генетик Альфред Кнудсон проанализировал возраст, в котором дети заболевают, и предложил объяснение [13]. Для развития опухоли нужно два «удара» — две мутации в одной клетке.

• При наследственной форме ребёнок получает одну мутацию от родителя, и она есть во всех клетках. Достаточно одного нового «удара» в любой из миллионов клеток сетчатки, и это происходит почти наверняка, причём часто в нескольких клетках.
• При спорадической форме обе мутации должны случайно произойти в одной и той же клетке. Это маловероятно, поэтому опухоль бывает одна и развивается позже.

Через пятнадцать лет нашли и сам ген — RB1. Оказалось, что «удары» поражают обе его копии. Гипотеза Кнудсона объяснила общий принцип генов-супрессоров: пока работает хотя бы одна копия, «тормоз» действует; опухоль возникает, только когда выключены обе. По этому же принципу наследуется предрасположенность к раку молочной железы и яичников при мутациях генов BRCA1 и BRCA2, а также при синдроме Ли — Фраумени.

Рак развивается постепенно

Одной мутации для рака недостаточно. В 1988 году Берт Фогельштейн и его коллеги исследовали опухоли толстой кишки на разных стадиях — от мелких полипов до раковых опухолей с метастазами — и показали, что по мере роста опухоли в ней накапливаются изменения разных генов: сначала обычно выключается ген-супрессор APC, затем активируется онкоген KRAS, позже теряются другие супрессоры, в том числе TP53 [14].

1. Нормальный эпителий кишки.
2. Утрата APC — клетки начинают делиться чаще, образуется небольшой полип.
3. Мутация KRAS — полип растёт, становится крупной аденомой.
4. Утрата TP53 и других супрессоров — аденома превращается в рак, который прорастает в стенку кишки.
5. Новые изменения — метастазы.

Путь от первой мутации до рака занимает обычно десятки лет. Этим объясняется, почему рак — в основном болезнь пожилого возраста, и почему так полезна ранняя диагностика: полип, удалённый при обследовании, уже никогда не станет раком.

Признаки опухолевой клетки

В 2000 году Дуглас Ханахан и Роберт Вайнберг сформулировали общие свойства, которые приобретают клетки любой злокачественной опухоли, а в 2011 году дополнили список [15]. Главные из них:

• способность делиться без внешних сигналов роста;
• нечувствительность к сигналам, тормозящим деление;
• устойчивость к апоптозу;
• неограниченное число делений — обычно благодаря включённой теломеразе (подробно — в статье «Теломеры и теломераза»);
• способность вызывать рост кровеносных сосудов, питающих опухоль;
• способность прорастать в ткани и давать метастазы;
• изменённый обмен веществ: опухолевые клетки получают энергию в основном гликолизом даже при наличии кислорода;
• способность ускользать от иммунной системы.

Каждое из этих свойств обеспечивается изменением определённых генов, и почти все они так или иначе связаны с нарушением регуляции клеточного цикла и апоптоза.

9. Причины рака и его профилактика

Вещества и воздействия, которые повышают риск рака, называют канцерогенами. Почти все они действуют одинаково: повреждают ДНК и вызывают мутации, в том числе в протоонкогенах и генах-супрессорах.

История химических канцерогенов началась в 1775 году, когда лондонский хирург Персиваль Потт заметил, что трубочисты часто болеют раком кожи мошонки. Мальчиков с раннего детства заставляли лазить по узким дымоходам, и сажа годами оставалась на их коже. Это первое описание профессионального рака. Через полтора века японские учёные Ямагива и Итикава в 1915 году вызвали опухоли у кроликов, месяцами смазывая им уши каменноугольной смолой, а в 1930-е годы из смолы выделили бензпирен — вещество, которое и вызывает рак.

Как вирус папилломы отключает «тормоза»

Вирусы папилломы человека высокого риска дают особенно наглядный пример связи рака с регуляцией цикла. Вирус размножается в клетках эпителия, которые уже вышли из цикла. Чтобы получить ферменты репликации, ему нужно заставить клетку снова войти в S-период. Для этого у него есть два белка:

• E7 связывает белок Rb и освобождает E2F — клетка вступает в S-период без сигналов роста;
• E6 присоединяет к p53 убиквитин и отправляет его на разрушение — клетка не может ни остановиться, ни погибнуть, даже если её ДНК повреждена.

Так вирус одновременно выключает оба главных «тормоза». Обычно иммунная система уничтожает заражённые клетки, но если инфекция держится годами, в клетках накапливаются мутации, и может развиться рак шейки матки. За открытие связи вируса папилломы с этим раком немецкий врач Харальд цур Хаузен получил Нобелевскую премию 2008 года. Сейчас против опасных типов вируса есть вакцины: в странах, где вакцинировали большинство девочек, предраковые изменения шейки матки стали встречаться в несколько раз реже.

Профилактика

Большую часть случаев рака можно предотвратить или вылечить на ранней стадии. Главные меры: отказ от курения (табак — причина почти каждого пятого случая смерти от рака в мире), защита кожи от избытка ультрафиолета, вакцинация против вируса папилломы и гепатита B, поддержание нормальной массы тела, физическая активность, умеренность в алкоголе, регулярные обследования, позволяющие найти опухоль, пока она мала.

10. Как лечат рак, воздействуя на цикл

Опухолевые клетки обычно делятся чаще нормальных, поэтому многие противоопухолевые препараты действуют на деление. Классические химиопрепараты бьют по разным этапам цикла.

Недостаток таких препаратов — они повреждают и нормальные быстро делящиеся клетки: клетки костного мозга, эпителия кишки, волосяных луковиц. Отсюда и побочные эффекты химиотерапии: снижение числа лейкоцитов, тошнота, выпадение волос. Паклитаксел, кстати, впервые выделили из коры тихоокеанского тиса, а винкристин — из листьев розового барвинка, растения с Мадагаскара.

Современные препараты действуют прицельно — на белки, изменённые именно в опухоли. Их называют таргетными (от англ. target — мишень).

• Иматиниб. При хроническом миелолейкозе обмен участками между хромосомами 9 и 22 (так называемая филадельфийская хромосома) создаёт слитый ген BCR-ABL, белок которого — постоянно активная киназа. Иматиниб блокирует именно эту киназу. До его появления в 2001 году болезнь была почти всегда смертельной, теперь большинство больных живут почти столько же, сколько здоровые люди.
• Трастузумаб — антитело против рецептора HER2, которого слишком много в некоторых опухолях молочной железы.
• Ингибиторы CDK4/6 (палбоциклиб и родственные) блокируют комплекс циклина D с CDK4/6, не давая клеткам опухоли пройти точку рестрикции. Их применяют при раке молочной железы с 2015 года.

Третье направление — иммунотерапия. На поверхности лимфоцитов есть белки-«тормоза», которые не дают иммунной системе атаковать собственные клетки организма. Опухоль использует их: выставляет белки, которые нажимают на эти «тормоза» и выключают лимфоциты. Препараты-антитела блокируют «тормоза», и лимфоциты начинают уничтожать опухоль. Иронично, что эти белки тоже называют контрольными точками — контрольными точками иммунитета; к контрольным точкам клеточного цикла они отношения не имеют. За открытие этого подхода Джеймс Эллисон и Тасуку Хондзё получили Нобелевскую премию 2018 года. При меланоме с метастазами, которая раньше почти не поддавалась лечению, такие препараты позволяют многим больным жить годами.

Ещё один подход — клетки CAR-T: у больного берут лимфоциты, с помощью вирусного вектора встраивают в них ген рецептора, узнающего белок опухоли, размножают в лаборатории и возвращают в кровь. Такие клетки особенно хорошо работают при некоторых лейкозах и лимфомах.

11. Итог: как устроена регуляция цикла

1. Переходы между периодами цикла запускают комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами. Киназа постоянно есть в клетке, а циклины синтезируются и разрушаются в определённые периоды.
2. Порядок комплексов: циклин D–CDK4/6 (G₁) → циклин E–CDK2 (G₁/S) → циклин A–CDK2 (S) → циклин B–CDK1 (G₂/M).
3. Разрушение белков с помощью убиквитина и протеасомы делает переходы необратимыми: разрушение секурина запускает анафазу, разрушение циклина B — выход из митоза.
4. Решение о делении принимается в точке рестрикции в G₁: факторы роста вызывают синтез циклина D, фосфорилирование белка Rb освобождает фактор транскрипции E2F.
5. Контрольные точки G₁/S, S, G₂/M и контрольная точка веретена останавливают цикл, если ДНК повреждена, не удвоена или хромосомы не прикреплены к веретену.
6. При повреждении ДНК накапливается белок p53. Он останавливает цикл через ингибитор p21, запускает репарацию, а если повреждение неисправимо — апоптоз или старение клетки.
7. Рак возникает при накоплении мутаций в протоонкогенах (превращаются в онкогены, работающие постоянно) и генах-супрессорах (выключаются обе копии). Обычно для злокачественной опухоли нужно несколько мутаций, и накапливаются они годами.

12. Частые ошибки

• «Циклин — это фермент». Циклин сам ничего не фосфорилирует; он регуляторная субъединица, которая включает циклин-зависимую киназу и направляет её на нужные белки.
• «Количество киназ меняется по ходу цикла». Меняется количество циклинов; количество циклин-зависимых киназ почти постоянно.
• «p53 — онкоген». Нормальный p53 — ген-супрессор опухолей. Так его считали ошибочно в первые десять лет, потому что изучали мутантный вариант.
• «Онкоген — это вирусный ген». Онкогены есть у вирусов, но в большинстве опухолей человека онкоген — это изменённый собственный протоонкоген клетки.
• «Протоонкогены вредны, и лучше бы их не было». Протоонкогены необходимы: без них клетки не могли бы делиться при росте, заживлении ран, обновлении тканей.
• «Для рака достаточно одной мутации». Как правило, нужны изменения нескольких генов: и включение онкогенов, и выключение супрессоров.
• «Рак всегда наследуется». Наследственные формы составляют лишь около 5–10 % случаев. Наследуется не сам рак, а повышенная предрасположенность — одна уже изменённая копия гена-супрессора.
• «Опухоль — это любые лишние клетки». Опухоль — разрастание клеток, вышедших из-под контроля регуляции. Гиперплазия — увеличение числа нормальных клеток, например мозолистое утолщение кожи, — опухолью не является и прекращается, когда исчезает причина.
• «Ингибиторы контрольных точек останавливают цикл опухоли». В иммунотерапии «контрольными точками» называют белки-«тормоза» лимфоцитов; препараты против них не действуют на цикл опухолевых клеток, а включают иммунный ответ.
• «Контрольная точка — это фаза цикла». Контрольная точка — механизм проверки на переходе между периодами, а не отдельный период.
• «Клетки в G₀ мертвы или не работают». Клетки в G₀ живы и выполняют свои функции — нейроны, мышечные волокна, клетки печени; они только не делятся.
• «Химиопрепараты действуют только на опухоль». Классические химиопрепараты поражают все быстро делящиеся клетки, поэтому у них много побочных эффектов.

13. Интересные факты

• Лиланд Хартвелл находил мутантов дрожжей, у которых цикл останавливался при повышенной температуре. Такие мутации называют температурочувствительными: при 23 °C клетки делятся нормально, а при 36 °C все клетки культуры останавливаются на одном и том же этапе, и по их внешнему виду — например, по размеру почки у почкующихся дрожжей — сразу видно, где именно.
• Пол Нерс, получивший Нобелевскую премию за открытие главной киназы цикла, в юности не мог поступить в университет из-за того, что не сдал обязательный экзамен по французскому языку. В университет его всё-таки приняли, а позже он стал президентом Лондонского королевского общества.
• Ген MDM2 назван по месту, где его нашли: на «двойных мелких хромосомах» в клетках мышиной линии 3T3-DM (от англ. mouse double minute 2). Двойные мелкие хромосомы — маленькие кольцевые фрагменты ДНК, на которых в опухолевых клетках умножаются копии онкогенов.
• Белок p53 при разделении в геле выглядит тяжелее, чем он есть: из-за множества остатков пролина он движется медленнее и кажется белком массой 53 тысячи дальтон, хотя по расчёту по аминокислотной последовательности его масса около 44 тысяч.
• Тасманийские дьяволы страдают от заразного рака: опухоль лица передаётся от одного животного к другому при укусах, и переносятся сами опухолевые клетки. С 1996 года, когда болезнь впервые заметили, численность вида сократилась примерно на три четверти. Похожий заразный рак есть у собак — он возник несколько тысяч лет назад у одной собаки и до сих пор живёт, передаваясь от животного к животному.
• Морские ежи, на которых был открыт циклин, сами живут очень долго: красный морской ёж может доживать до 100 лет и более, почти не проявляя признаков старения.
• Клетки HeLa, взятые в 1951 году из опухоли шейки матки Генриетты Лакс, делятся в лабораториях до сих пор. В них встроена ДНК вируса папилломы 18-го типа, белки которого выключают p53 и Rb, а теломераза в этих клетках активна.
• Многие гены человека способны работать в дрожжах. В 2015 году попробовали заменить человеческими генами около четырёхсот жизненно важных генов пекарских дрожжей, и почти в половине случаев дрожжи выжили. Особенно хорошо заменяются гены, работающие в одних и тех же процессах, — например, в разрушении белков протеасомой.
• Слово «рак» восходит к Гиппократу: он назвал некоторые опухоли «карцинос» — краб, потому что расходящиеся от опухоли сосуды напоминали ему клешни краба.

14. Частые вопросы

15. ЕГЭ

Регуляция клеточного цикла входит в элемент 2.6 кодификатора [16]. В заданиях части 1 спрашивают, что такое контрольные точки, какие процессы происходят в периодах интерфазы, чем опасно нарушение регуляции деления. В части 2 встречаются вопросы о причинах опухолей, о действии мутагенов и канцерогенов, о том, почему колхицин и другие вещества останавливают деление, о значении апоптоза. Подробных знаний о конкретных циклинах на экзамене не требуется, но понимание принципа — «двигатель» и «тормоза» — помогает рассуждать в любом вопросе.

Что обязательно знать к экзамену

• Периоды клеточного цикла и события каждого периода; состояние G₀.
• Что такое контрольные точки и что они проверяют (G₁/S, G₂/M, контрольная точка веретена).
• Что деление регулируется белками — циклинами и циклин-зависимыми киназами — и внешними сигналами (факторы роста, контакт с соседними клетками).
• Роль p53: остановка цикла при повреждении ДНК, репарация, апоптоз.
• Причины опухолей: мутации генов, регулирующих деление; канцерогены химические, физические, биологические.
• Отличие доброкачественной и злокачественной опухоли; что такое метастазы.

Разбор вопроса части 2

Вопрос. Почему клетки злокачественной опухоли делятся неограниченно? Приведите не менее трёх причин.

Ответ.

1. В клетках опухоли произошли мутации генов, контролирующих клеточный цикл: протоонкогены превратились в онкогены, постоянно стимулирующие деление.
2. Выключены гены-супрессоры (например, p53), поэтому клетка с повреждённой ДНК не останавливает цикл и не вступает в апоптоз.
3. Клетки утратили контактное торможение и зависимость от факторов роста.
4. В клетках опухоли активна теломераза, поэтому теломеры не укорачиваются и число делений не ограничено.

Разбор вопроса о мутагенах

Вопрос. Почему ультрафиолетовое излучение повышает риск рака кожи? Почему загар защищает кожу лишь частично?

Ответ. 1) Ультрафиолет повреждает ДНК клеток кожи: соседние тиминовые основания одной цепи сшиваются друг с другом, образуя димеры. 2) Если повреждения не исправлены репарацией, при репликации возникают мутации; если они затрагивают гены, регулирующие деление (например, p53), клетка может дать начало опухоли. 3) При загаре в коже синтезируется пигмент меланин, поглощающий часть ультрафиолета, но он не задерживает излучение полностью, и повреждения ДНК всё равно возникают — поэтому загар не заменяет защиту от солнца.

Связь с другими темами

Вопросы о регуляции цикла часто сочетаются с темами мутаций и репарации, митоза и мейоза, иммунитета. Например, чтобы объяснить действие колхицина, нужно знать устройство веретена деления (статья «Митоз»), а чтобы объяснить, почему опухоль у ребёнка с ретинобластомой бывает в обоих глазах, — законы наследования и понятие гетерозиготы.

16. Для олимпиад

Гипотеза Кнудсона в числах

Пусть вероятность «удара» — мутации, выключающей одну определённую копию гена RB1, — в одной клетке сетчатки за период её развития равна 10⁻⁷, а таких клеток в сетчатке одного глаза около 10⁷. Тогда:

• при наследственной форме в каждой клетке одна копия уже выключена, и опухоль возникает, если «ударена» вторая копия. Ожидаемое число таких клеток в глазу: 10⁷ × 10⁻⁷ × 2 (вторая копия может быть выключена и точечной мутацией, и утратой участка хромосомы — грубо удвоим) ≈ 2 — почти наверняка хотя бы одна опухоль в каждом глазу;
• при спорадической форме нужны два независимых «удара» в одной клетке. Вероятность для одной клетки — порядка 10⁻⁷ × 10⁻⁷ = 10⁻¹⁴, на глаз — порядка 10⁻⁷, а опухоль в обоих глазах сразу — порядка 10⁻¹⁴, то есть практически никогда. В действительности спорадическая ретинобластома встречается чаще, чем по такому грубому расчёту, — примерно у одного ребёнка из 30–40 тысяч: если первая мутация произошла рано, её получают тысячи клеток-потомков, и шансы на второй «удар» растут. Но и тогда опухоль почти всегда одна.

Числа здесь условные, но порядок величин передаёт логику Кнудсона: опухоль в обоих глазах при спорадической форме практически невозможна, а при наследственной встречается часто. По той же логике Кнудсон предсказал, что у детей с наследственной формой число опухолей в глазу подчиняется распределению Пуассона, а время возникновения опухоли описывается кривой «одного удара», тогда как у спорадических случаев — кривой «двух ударов».

Почему одна мутантная копия p53 бывает опасной

Ген-супрессор обычно рецессивен на уровне клетки, но у TP53 есть особенность. Белок p53 работает не поодиночке, а в виде тетрамера — комплекса из четырёх молекул. Многие мутантные молекулы p53 сохраняют способность входить в тетрамер, но не связывают ДНК, и тетрамер, в котором есть хотя бы одна такая молекула, не работает. Если в клетке поровну нормальных и мутантных молекул и они собираются в тетрамеры случайно, то целиком нормальным окажется тетрамер с вероятностью (1/2)⁴ = 1/16, то есть работать будет лишь около 6 % комплексов. Одна мутантная копия выключает почти всю функцию, а не половину. Такое действие называют доминантно-негативным. Поэтому в опухолях TP53 часто изменён точечными мутациями, которые дают «испорченный» белок, а не просто утрачен.

Что показывают опыты со слиянием клеток

В 1970 году Поттер Рао и Роберт Джонсон сливали клетки HeLa, находящиеся в разных периодах цикла, и следили за ядрами в образовавшейся двухъядерной клетке [17]. Результаты удобно свести в таблицу.

Эти опыты задолго до открытия циклинов показали, что состояние ядра определяется веществами цитоплазмы, и поставили две важнейшие загадки — «лицензирование» репликации и природу фактора митоза. Обе разгаданы через десятилетия.

Почему клетки рака часто имеют «неправильное» число хромосом

Анеуплоидия — изменённое число хромосом — характерна для большинства солидных опухолей. Её причины связаны с нарушением регуляции: ослабленная контрольная точка веретена пропускает клетки с неприкреплёнными хромосомами в анафазу, лишние центросомы образуют многополюсные веретёна, утрата p53 позволяет выжить клеткам, которые в норме погибли бы после ошибочного деления. В редких случаях хромосома разбивается на десятки кусков и собирается в случайном порядке за одно-единственное «катастрофическое» событие — хромотрипсис, описанный в 2011 году [18].

17. Задания с разбором

Задание 1

Установите последовательность активации комплексов циклин–CDK в клеточном цикле: А) циклин B–CDK1; Б) циклин E–CDK2; В) циклин D–CDK4/6; Г) циклин A–CDK2.

Задание 2

Выберите три верных ответа. Белок p53: 1) накапливается в клетке при повреждении ДНК; 2) является ферментом, синтезирующим ДНК; 3) может запускать апоптоз; 4) включает синтез ингибитора циклин-зависимых киназ; 5) стимулирует деление клетки; 6) входит в состав веретена деления.

Задание 3

Установите соответствие между генами и группами. Гены: А) RAS; Б) TP53; В) RB1; Г) MYC; Д) BRCA1; Е) ген циклина D. Группы: 1) протоонкогены; 2) гены-супрессоры опухолей.

Задание 4

Найдите ошибки в тексте. (1) Переходы между периодами клеточного цикла регулируют комплексы циклинов с циклин-зависимыми киназами. (2) Количество циклин-зависимых киназ резко меняется в ходе цикла, а количество циклинов постоянно. (3) Контрольная точка веретена не допускает начала анафазы, пока все хромосомы не прикреплены к микротрубочкам. (4) Белок p53 — онкоген, стимулирующий деление. (5) Мутации генов-супрессоров приводят к утрате их функции.

Задание 5

Что такое контрольная точка клеточного цикла? Приведите два примера и укажите, что проверяется в каждой.

Задание 6

Выберите три верных ответа. Признаки злокачественной опухоли: 1) прорастает в соседние ткани; 2) окружена капсулой и растёт только на месте; 3) даёт метастазы; 4) клетки утратили контактное торможение; 5) клетки делятся только под действием факторов роста; 6) клетки делятся ограниченное число раз.

Задание 7

Установите соответствие между канцерогенами и их группами. Канцерогены: А) ультрафиолет; Б) бензпирен; В) вирус папилломы человека; Г) рентгеновское излучение; Д) асбест; Е) вирус гепатита B. Группы: 1) химические; 2) физические; 3) биологические.

Задание 8

Почему клетки, в которых ингибирован синтез циклина D, не вступают в S-период даже в присутствии факторов роста?

Задание 9

Объясните, почему у детей с наследственной формой ретинобластомы опухоли часто возникают в обоих глазах, а при спорадической форме — в одном.

Задание 10

Выберите три верных ответа. При повреждении ДНК в клетке может произойти: 1) остановка цикла в G₁; 2) активация репарации; 3) апоптоз; 4) ускорение репликации; 5) немедленное вступление в митоз; 6) удвоение числа центриолей.

Задание 11

Установите последовательность событий при переходе клетки через точку рестрикции: А) освобождение E2F и включение генов S-периода; Б) связывание фактора роста с рецептором; В) синтез циклина D; Г) фосфорилирование белка Rb; Д) начало репликации ДНК.

Задание 12

Белок E7 вируса папилломы человека связывает белок Rb, а белок E6 вызывает разрушение p53. Почему заражение этим вирусом повышает риск рака?

Задание 13

Выберите три верных ответа. Циклины: 1) синтезируются и разрушаются в определённые периоды цикла; 2) активируют циклин-зависимые киназы; 3) являются нуклеиновыми кислотами; 4) разрушаются с помощью убиквитина и протеасомы; 5) входят в состав центромер; 6) присутствуют в клетке в постоянном количестве.

Задание 14

Почему химиотерапия вызывает выпадение волос, снижение числа лейкоцитов и расстройство пищеварения?

Задание 15

Установите соответствие между свойствами и генами. Свойства: А) для изменения функции клетки достаточно одной изменённой копии; Б) нормальный продукт тормозит деление; В) мутация усиливает функцию; Г) опухоль возникает при утрате обеих копий; Д) пример — RAS. Гены: 1) протоонкоген; 2) ген-супрессор опухолей.

Задание 16

В эксперименте клетку в митозе слили с клеткой в G₁. Что произойдёт с хромосомами G₁-ядра? О чём это говорит?

Задание 17

Выберите три верных ответа. Для нормальных клеток, в отличие от опухолевых, характерно: 1) контактное торможение; 2) деление только при наличии факторов роста; 3) неограниченное число делений; 4) апоптоз при неисправимом повреждении ДНК; 5) способность давать метастазы; 6) постоянно активная теломераза в большинстве соматических клеток.

Задание 18

Почему рак у людей чаще всего развивается в пожилом возрасте? Приведите не менее двух причин.

Задание 19 (олимпиадное)

В клетку ввели изменённый циклин B, который не может связываться с убиквитином. Клетка вступила в митоз, сестринские хроматиды разошлись к полюсам, но хромосомы не деспирализовались, и ядерные оболочки не образовались. Объясните результат. Что произойдёт, если вместо этого ввести неразрушаемый секурин?

Задание 20 (олимпиадное)

У африканского слона около 20 копий гена TP53, у человека — одна пара. Масса слона примерно в 70 раз больше массы человека, а продолжительность жизни сопоставима. 1) Объясните, почему в отсутствие особых механизмов следовало бы ожидать, что слоны будут болеть раком чаще людей. 2) Как дополнительные копии TP53 могут защищать слона от рака? 3) Почему такой защитный механизм вряд ли мог бы просто «повысить» активность p53 во всех клетках без вреда для организма?

Литература

1. Evans T., Rosenthal E. T., Youngblom J. et al. Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division // Cell. 1983. Vol. 33. P. 389–396.
2. Hartwell L. H., Weinert T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events // Science. 1989. Vol. 246. P. 629–634.
3. Lee M. G., Nurse P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2 // Nature. 1987. Vol. 327. P. 31–35.
4. Coudreuse D., Nurse P. Driving the cell cycle with a minimal CDK control network // Nature. 2010. Vol. 468. P. 1074–1079.
5. Masui Y., Markert C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes // Journal of Experimental Zoology. 1971. Vol. 177. P. 129–145.
6. Pardee A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1974. Vol. 71. P. 1286–1290.
7. Rieder C. L., Cole R. W., Khodjakov A., Sluder G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores // Journal of Cell Biology. 1995. Vol. 130. P. 941–948.
8. Lane D. P., Crawford L. V. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells // Nature. 1979. Vol. 278. P. 261–263.
9. Lane D. P. p53, guardian of the genome // Nature. 1992. Vol. 358. P. 15–16.
10. Sulak M., Fong L., Mika K. et al. TP53 copy number expansion is associated with the evolution of increased body size and an enhanced DNA damage response in elephants // eLife. 2016. Vol. 5. Art. e11994.
11. Abegglen L. M., Caulin A. F., Chan A. et al. Potential mechanisms for cancer resistance in elephants and comparative cellular response to DNA damage in humans // JAMA. 2015. Vol. 314. P. 1850–1860.
12. Stehelin D., Varmus H. E., Bishop J. M., Vogt P. K. DNA related to the transforming gene(s) of avian sarcoma viruses is present in normal avian DNA // Nature. 1976. Vol. 260. P. 170–173.
13. Knudson A. G. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1971. Vol. 68. P. 820–823.
14. Vogelstein B., Fearon E. R., Hamilton S. R. et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development // New England Journal of Medicine. 1988. Vol. 319. P. 525–532.
15. Hanahan D., Weinberg R. A. Hallmarks of cancer: the next generation // Cell. 2011. Vol. 144. P. 646–674.
16. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.
17. Rao P. N., Johnson R. T. Mammalian cell fusion: studies on the regulation of DNA synthesis and mitosis // Nature. 1970. Vol. 225. P. 159–164.
18. Stephens P. J., Greenman C. D., Fu B. et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development // Cell. 2011. Vol. 144. P. 27–40.