Метод меченых атомов (метод изотопных индикаторов) позволяет проследить путь вещества в организме или клетке: откуда берётся кислород при фотосинтезе, как копируется ДНК, куда направляется синтезированный белок. Многие ключевые открытия биологии XX века сделаны этим методом, и в заданиях ЕГЭ он встречается всё чаще — в виде описания опыта, результат которого нужно объяснить или предсказать. В статье по порядку разобраны физическая основа метода, способы обнаружения метки, классические опыты и правила решения задач.
- 1. Изотопы
- 2. Принцип метода
- 3. Как обнаруживают метку
- 4. Импульсная метка и «погоня»
- 5. Классические опыты
- 6. Меченые атомы в медицине
- 7. Как решать задачи
- 8. Типичные ошибки
- 9. Для олимпиад
- Задания с разбором
1. Изотопы
Изотопы — разновидности атомов одного химического элемента с одинаковым числом протонов в ядре (одинаковым зарядом ядра), но разным числом нейтронов, а значит, разной массой. Например, у углерода есть изотопы 12C (6 протонов и 6 нейтронов), 13C (7 нейтронов) и 14C (8 нейтронов). Подробнее о строении ядер — в статье «Нуклиды и изотопы».
Химические свойства определяются электронной оболочкой, а она у изотопов одного элемента одинакова. Поэтому изотопы вступают в те же реакции и в живой клетке ведут себя практически так же, как обычные атомы. Небольшие различия в скорости реакций (изотопный эффект) заметны только у самых лёгких элементов, особенно у водорода, у которого масса изотопов отличается вдвое и втрое.
| Изотоп | Тип | Где используется |
|---|---|---|
| 3H (тритий) | Радиоактивный | Меченый тимидин (ДНК), уридин (РНК), аминокислоты (белки) |
| 14C | Радиоактивный | Путь углерода в фотосинтезе, дыхании, обмене веществ |
| 32P | Радиоактивный | Нуклеиновые кислоты, АТФ, фосфолипиды |
| 35S | Радиоактивный | Белки (сера есть в метионине и цистеине, в нуклеиновых кислотах её нет) |
| 131I | Радиоактивный | Щитовидная железа и её гормоны |
| 15N | Стабильный, тяжёлый | Белки, нуклеиновые кислоты, азотистый обмен |
| 18O | Стабильный, тяжёлый | Происхождение кислорода и воды в реакциях |
| 2H (дейтерий), 13C | Стабильные | Обмен веществ, диагностика |
2. Принцип метода
Организму или клеткам дают вещество, в котором часть атомов заменена изотопом. Затем через определённое время определяют, в каких веществах, органоидах или органах оказалась метка. Поскольку меченые молекулы участвуют в тех же процессах, что и обычные, по пути метки судят о пути вещества.
Важно понимать, что метка — это атом, а не молекула. Молекула может распасться, а атом перейти в другое вещество. Поэтому в задаче нужно следить, какой именно атом помечен и в какие продукты он может перейти.
3. Как обнаруживают метку
- Радиоактивные изотопы распадаются, испуская излучение. Их обнаруживают счётчиками (газоразрядными, сцинтилляционными) или методом авторадиографии: срез ткани или клетки покрывают фотоэмульсией, и излучение засвечивает её над местами нахождения метки; под микроскопом видны тёмные зёрна серебра.
- Стабильные тяжёлые изотопы не излучают. Их обнаруживают по массе: масс-спектрометром, разделяющим ионы по массе, или центрифугированием в градиенте плотности — молекулы с тяжёлыми изотопами плотнее и оседают ниже.
Радиоактивные изотопы обнаруживаются в ничтожных количествах, но опасны для организма; стабильные безопасны, но их определение сложнее.
4. Импульсная метка и «погоня»
Важный приём — импульсное мечение с последующей погоней (в литературе — «пульс-чейз»). Клеткам на короткое время (импульс) дают меченое вещество, а затем заменяют его избытком немеченого (погоня). Тогда метку получают только молекулы, синтезированные во время импульса, и можно наблюдать, как эта «волна» меченых молекул перемещается по клетке со временем. Без погони метка поступала бы непрерывно, и вся клетка постепенно оказалась бы меченой.
5. Классические опыты
Дьёрдь Хевеши: начало метода (1923)
Венгерский химик Дьёрдь Хевеши поместил растения конских бобов в раствор с радиоактивным изотопом свинца и проследил, как свинец поглощается и распределяется по органам. Это первое применение изотопной метки в биологии. Нобелевская премия по химии 1943 года.
Рудольф Шёнхаймер: динамическое состояние организма (1930-е)
Шёнхаймер давал мышам жирные кислоты с дейтерием и аминокислоты с 15N и обнаружил, что метка быстро появляется в жирах и белках тела, даже если масса животного не меняется. Вывод: вещества организма непрерывно разрушаются и синтезируются заново; «постоянство» тела — это динамическое равновесие.
Сэмюэл Рубен и Мартин Кеймен: кислород фотосинтеза (1941)
Одноклеточной зелёной водоросли хлорелле давали воду, меченную 18O, и обычный CO2 — меченый кислород выделялся. При мечении CO2 и обычной воде в выделяемом кислороде метки почти не было. Вывод: кислород фотосинтеза образуется из воды при фотолизе (подробнее — в статье «Фотосинтез»). Кислород из CO2 переходит в органические вещества и в воду, образующуюся при фотосинтезе.
Мелвин Кальвин: путь углерода (1946–1953)
Хлорелле на свету на несколько секунд давали 14CO2, затем быстро убивали клетки и разделяли вещества хроматографией. При самой короткой экспозиции метка находилась в 3-фосфоглицериновой кислоте — первом продукте фиксации CO2; при более длительной — в сахарах. Так был установлен цикл Кальвина (Нобелевская премия по химии 1961 года).
Альфред Херши и Марта Чейз: ДНК — наследственный материал (1952)
- Бактериофаги Т2 выращивали на бактериях в среде с 32P (метка ДНК) или с 35S (метка белка).
- Мечеными фагами заражали немеченые бактерии; через несколько минут смесь перемешивали в миксере, чтобы оторвать фаги от поверхности бактерий, и центрифугировали: бактерии оседали, частицы фагов оставались в жидкости.
- 32P оказался в основном в бактериях, 35S — в жидкости вместе с белковыми оболочками.
- Новые фаги, образовавшиеся в бактериях, содержали часть 32P, но не 35S.
Вывод: внутрь бактерии проникает ДНК фага, и именно она несёт информацию для образования новых фагов. Херши — Нобелевская премия 1969 года.
Мэтью Мезельсон и Франклин Сталь: полуконсервативная репликация (1958)
- Кишечную палочку много поколений выращивали на среде с тяжёлым азотом 15N: вся её ДНК стала «тяжёлой».
- Бактерий перенесли на среду с обычным 14N и отбирали пробы после каждого деления.
- ДНК центрифугировали в растворе хлорида цезия, образующем градиент плотности; ДНК собиралась в полосу на уровне, соответствующем её плотности.
- Результат: исходно — одна «тяжёлая» полоса; после первого деления — одна полоса промежуточной плотности; после второго — две полосы: промежуточная и «лёгкая» в равных количествах.
| Модель репликации | Ожидание после 1-го деления | Ожидание после 2-го деления | Соответствует опыту? |
|---|---|---|---|
| Консервативная (старая молекула целиком сохраняется, новая целиком новая) | Тяжёлая и лёгкая полосы | Тяжёлая и лёгкая (1 : 3) | Нет — опровергнута уже после 1-го деления |
| Полуконсервативная (каждая дочерняя молекула — одна старая и одна новая цепь) | Одна промежуточная | Промежуточная и лёгкая (1 : 1) | Да |
| Дисперсная (старые и новые участки перемешаны в обеих цепях) | Одна промежуточная | Одна полоса между промежуточной и лёгкой | Нет — опровергнута после 2-го деления |
Джеймс Герберт Тейлор: репликация хромосом (1957)
Корешки конских бобов выдерживали в среде с меченым тритием тимидином (нуклеотидом, входящим только в ДНК), а затем переносили в среду без метки. Авторадиография показала: после первого деления метка есть в обеих хроматидах каждой хромосомы, а после второго — только в одной из двух сестринских хроматид. Это подтвердило полуконсервативную репликацию на уровне хромосом.
Джордж Паладе: путь секреторного белка (1960-е)
Срезы поджелудочной железы морской свинки на 3 минуты помещали в среду с аминокислотой лейцином, меченной тритием, затем — в среду с избытком обычного лейцина (импульс и погоня). Авторадиография в электронном микроскопе показала, что метка последовательно перемещается: шероховатая ЭПС (через 3 минуты) → аппарат Гольджи (через 20 минут) → секреторные гранулы (через 2 часа) → выведение из клетки. Так был установлен путь секреторных белков. Нобелевская премия 1974 года.
6. Меченые атомы в медицине
- Радиоактивный йод 131I накапливается в щитовидной железе, которая использует йод для синтеза гормонов тироксина и трийодтиронина. По скорости накопления оценивают работу железы, а большие дозы применяют для лечения её опухолей и гиперфункции.
- Позитронно-эмиссионная томография: больному вводят аналог глюкозы с изотопом 18F. Клетки, активно поглощающие глюкозу (опухолевые, работающие участки мозга), накапливают метку, и прибор строит изображение.
- Дыхательный тест на хеликобактер: пациент выпивает раствор мочевины с 13C. Бактерия Helicobacter pylori в желудке расщепляет мочевину ферментом уреазой, и меченый CO2 появляется в выдыхаемом воздухе. У человека уреазы нет, поэтому метка в выдохе указывает на инфекцию.
7. Как решать задачи
- Определите, какой атом помечен и в составе какого вещества он введён.
- Вспомните, в какие процессы вступает это вещество и где они идут (в каких органоидах, органах).
- Проследите атом через реакции: в какие продукты он переходит, а в какие нет (например, сера есть в белках, но не в ДНК; фосфор — в ДНК, но в белках мало).
- Учтите время: что происходит сначала, что потом.
- Сформулируйте ответ: где обнаружится метка, в составе какого вещества и почему.
Много задач нового типа с подробными разборами — в статье «Следим за меткой: практикум». Метод разбирается также в уроке «Метод меченых атомов» и в тренажёре по теме 2.1.
8. Типичные ошибки
- «Изотопы — разные химические элементы» — это атомы одного элемента с разной массой.
- «Меченая молекула ведёт себя иначе, поэтому её можно отследить» — она ведёт себя так же; отслеживают её по радиоактивности или массе.
- «В опыте Херши и Чейз белок мечен фосфором, а ДНК серой» — наоборот: 32P — ДНК, 35S — белок.
- «Мезельсон и Сталь опровергли дисперсную модель после первого деления» — после первого деления опровергнута только консервативная модель, дисперсная — после второго.
- «Кислород из CO2 выделяется в атмосферу» — он переходит в органические вещества и воду, а выделяется кислород воды.
9. Для олимпиад
Период полураспада и выбор изотопа
Изотоп выбирают с учётом периода полураспада: 32P (около 14 суток) удобен для коротких опытов, 14C (около 5730 лет) и 3H (около 12 лет) почти не теряют активность за время опыта, а для медицинской диагностики выбирают изотопы с коротким периодом (18F — около 110 минут), чтобы облучение пациента было минимальным. Подробнее о периоде полураспада — в статье «Реакции первого порядка».
Расчёты в опыте Мезельсона и Сталя
После n делений на лёгкой среде из одной исходной тяжёлой молекулы образуется 2n молекул, из них гибридных (одна тяжёлая и одна лёгкая цепь) всегда только 2, остальные 2n − 2 — лёгкие. Доля гибридных молекул 2/2n: после 3 делений — 1/4, после 4 — 1/8.
Задания с разбором
Сначала ответьте сами, затем откройте разбор.
Задание 1
Чем изотопы одного элемента отличаются и что у них общего? Почему они пригодны для изучения процессов в клетке?
Разбор
1) Одинаковое число протонов (заряд ядра) и электронов, разное число нейтронов (масса). 2) Химические свойства практически одинаковы, поэтому меченые молекулы участвуют в тех же реакциях. 3) Метку можно обнаружить по радиоактивности или массе и проследить путь атома.
Задание 2
В опыте Херши и Чейз фаги, меченные 35S, после заражения и перемешивания оказались в жидкости, а меченные 32P — в осадке с бактериями. Почему фосфор использовали для мечения ДНК, а серу — для белка? Какой вывод сделали авторы?
Разбор
1) Фосфор входит в состав ДНК (фосфатные группы), в белках фага его почти нет. 2) Сера входит в аминокислоты метионин и цистеин белков, в ДНК её нет. 3) Внутрь бактерии проникает ДНК, а белковая оболочка остаётся снаружи; новые фаги содержат метку ДНК — значит, наследственный материал фага — ДНК.
Задание 3
Бактерии, выросшие на среде с 15N, перенесли на среду с 14N. Какая доля молекул ДНК будет гибридной после трёх делений? Сколько полос и какой плотности даст центрифугирование?
Разбор
1) Из одной молекулы получится 23 = 8 молекул, гибридных из них 2 — доля 1/4. 2) Две полосы: промежуточной плотности (гибридные, 1/4) и лёгкая (3/4). 3) Тяжёлой полосы нет.
Задание 4
В опыте Паладе метка появилась в шероховатой ЭПС через 3 минуты, в аппарате Гольджи — через 20 минут, в секреторных гранулах — через 2 часа. Почему без «погони» (замены меченого лейцина обычным) нельзя было бы установить последовательность?
Разбор
1) Без погони метка поступала бы в белки непрерывно, и через некоторое время все органоиды содержали бы метку одновременно. 2) Погоня позволяет пометить только «порцию» белков, синтезированную за короткий импульс. 3) Наблюдая перемещение этой порции, можно установить порядок органоидов на пути секреторного белка.
Задание 5
Растению дали CO2, меченный 18O, и обычную воду. В каких веществах окажется метка? Будет ли она в выделяемом кислороде?
Разбор
1) Кислород CO2 переходит в органические вещества (глюкозу, крахмал) и в воду, образующуюся в цикле Кальвина. 2) В выделяемом кислороде метки не будет: он образуется при фотолизе воды. 3) Через некоторое время метка может появиться в O2 косвенно — если образовавшаяся меченая вода вступит в фотолиз.
Задание 6
Почему для изучения синтеза ДНК используют меченый тимидин, а для изучения синтеза РНК — меченый уридин?
Разбор
1) Тимин входит только в ДНК, поэтому метка тимидина попадает только в ДНК. 2) Урацил входит только в РНК, поэтому меченый уридин отражает синтез РНК. 3) Так можно отдельно изучать репликацию и транскрипцию.
Задание 7
Человеку для обследования ввели радиоактивный йод. В каком органе и в составе каких веществ будет обнаружена метка? Почему при гиперфункции органа она накапливается быстрее?
Разбор
1) В щитовидной железе, в составе гормонов тироксина и трийодтиронина. 2) Железа активно поглощает йод из крови для синтеза гормонов. 3) При гиперфункции синтез гормонов усилен, поэтому йод (и метка) поглощается быстрее и в большем количестве.
Задание 8
Корешки выдерживали в среде с меченым тимидином в течение одного клеточного цикла, затем перенесли в среду без метки и дали пройти ещё одному циклу. Сколько хроматид каждой метафазной хромосомы будут мечеными во втором митозе? Ответ поясните.
Разбор
1) В первом цикле каждая молекула ДНК реплицировалась полуконсервативно на меченой среде: в каждой хроматиде одна старая (немеченая) и одна новая (меченая) цепь. 2) Во втором цикле на немеченой среде каждая из этих цепей служит матрицей для немеченой цепи. 3) Хроматида, получившая меченую цепь, мечена, вторая — нет: во втором митозе метку несёт одна из двух сестринских хроматид.
Задание 9 (олимпиадное)
Почему в дыхательном тесте на хеликобактер можно использовать стабильный изотоп 13C, а не радиоактивный? Почему у здорового человека метка в выдыхаемом воздухе не появляется?
Разбор
1) 13C не радиоактивен и безопасен, а его долю в выдыхаемом CO2 можно точно измерить масс-спектрометром или инфракрасным анализатором. 2) Метка переходит в CO2 только при расщеплении мочевины ферментом уреазой. 3) У человека уреазы нет; она есть у бактерии хеликобактер, поэтому появление меченого CO2 указывает на инфекцию.
Задание 10 (олимпиадное)
Предложите опыт с мечеными атомами, позволяющий выяснить, используется ли глюкоза, поступающая в мышцу, для синтеза гликогена или окисляется до CO2. Какие результаты ожидаются при каждом варианте?
Разбор
1) Дать мышце (или животному) глюкозу с 14C. 2) Через разное время измерять метку в гликогене мышцы и в выдыхаемом CO2. 3) Если глюкоза запасается, метка накапливается в гликогене; если окисляется — появляется в CO2. 4) Сравнение при покое и при нагрузке покажет, как соотношение меняется: при работе доля окисления растёт, в покое после еды — доля синтеза гликогена.
Литература
- Meselson M., Stahl F. W. The replication of DNA in Escherichia coli // PNAS. 1958. Vol. 44. P. 671–682.
- Hershey A. D., Chase M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage // Journal of General Physiology. 1952. Vol. 36. P. 39–56.
- Ruben S. et al. Heavy oxygen (O18) as a tracer in the study of photosynthesis // Journal of the American Chemical Society. 1941. Vol. 63. P. 877–879.
- Jamieson J. D., Palade G. E. Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell // Journal of Cell Biology. 1967. Vol. 34. P. 577–596.
Обсуждение
Загружаем обсуждение…