Методы молекулярной биологии
ПЦР и секвенирование
linkОпора
- Урок 382. Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты — рисовать нуклеотиды и комплементарные пары
Методы молекулярной биологии — это прикладная органическая химия нуклеиновых кислот (урок 382). Полимераза присоединяет нуклеотиды только к свободной группе 3′-OH, а пары оснований удерживаются водородными связями, которые разрываются при нагревании и снова образуются при охлаждении. На этих двух фактах построены и полимеразная цепная реакция (ПЦР), и секвенирование.
Как рассуждать о ПЦР и секвенировании
- ПЦР повторяет цикл из трёх стадий: при нагревании до 94–98 °C цепи ДНК разделяются (денатурация), при охлаждении праймеры связываются с границами нужного участка (отжиг), а полимераза достраивает новые цепи от 3′-конца праймеров. Число копий за цикл удваивается: \(N = N_0 \cdot 2^n\).
- Используйте термостабильную полимеразу (Taq-полимеразу из термофильной бактерии): она выдерживает стадию денатурации, и её не нужно добавлять заново в каждом цикле.
- Секвенирование по Сэнгеру: в смесь добавляют немного дидезоксинуклеотида (ddNTP), у которого нет группы 3′-OH. Присоединив его, полимераза не может продолжить цепь, и синтез обрывается; по длинам оборванных фрагментов читают последовательность.
- Помните о праймере: он задаёт начало синтеза, и его 3′-конец должен быть комплементарен матрице.
Примеры
1. Рост числа копий. За 30 циклов ПЦР из одной молекулы ДНК можно получить до \(2^{30} ≈ 10^9\) копий нужного участка.
2. Обрыв цепи по Сэнгеру. Если в смесь добавлен ddATP, синтез обрывается каждый раз, когда полимераза присоединяет дидезоксиаденозин напротив остатка T матрицы (пара \(\ce{A-T}\)). Длины оборванных фрагментов показывают, в каких положениях матрицы стоят остатки T.
errorПраймеров два, и они направлены навстречу друг другу
Один праймер комплементарен одной цепи, другой — второй, и полимераза достраивает их навстречу друг другу. Поэтому копируется участок между праймерами, а число копий растёт экспоненциально; с одним праймером рост был бы только линейным.
edit_noteПопробуйте сами
Почему праймеры не связываются с матрицей на стадии денатурации?
expand_moreПоказать решение
При 94–98 °C водородные связи пар оснований разрываются, и дуплекс праймера с матрицей неустойчив; праймеры связываются только при охлаждении на стадии отжига.
Электрофорез и синтез олигонуклеотидов
Праймеры для ПЦР синтезируют химически — циклами из четырёх реакций на твёрдом носителе, как пептиды в синтезе Меррифилда (урок 378). А продукты ПЦР, секвенирования и химического синтеза разделяют и анализируют электрофорезом в геле.
Как считать синтез и разделение
- При электрофорезе ДНК, заряженная отрицательно благодаря фосфатным группам, движется к положительному электроду, и короткие фрагменты проходят через гель быстрее длинных. Белки в присутствии SDS разделяются по массе.
- Амидофосфитный синтез идёт от 3′-конца к 5′-концу: 3′-концевой нуклеозид пришит к носителю, и каждый цикл добавляет один нуклеотид к его группе 5′-OH.
- В каждом цикле четыре стадии. Дихлоруксусная кислота снимает защитную группу DMTr с группы 5′-OH (детритилирование), затем освободившаяся группа конденсируется с 5′-DMTr-нуклеозид-3′-амидофосфитом в присутствии тетразола. Непрореагировавшие группы 5′-OH ацетилируют уксусным ангидридом (кэпирование), а фосфит-триэфир окисляют до фосфат-триэфира раствором иода в водном пиридине.
- Олигонуклеотид из n звеньев требует n − 1 конденсаций, поэтому общий выход равен (выход конденсации)ⁿ⁻¹.
- Основания защищают бензоильной (A, C) и изобутирильной (G) группами, а тимин не защищают; в конце концентрированный аммиак снимает все защиты и отщепляет олигонуклеотид от носителя.
Примеры
1. Выход праймера. Для 20-звенного праймера при выходе конденсации 99 % общий выход равен \(0{,}99^{19} = 0{,}83\), то есть 83 %.
2. Кэпирование. Уксусный ангидрид \(\ce{Ac2O}\) ацетилирует свободные группы 5′-OH, которые не вступили в конденсацию. Такие цепи больше не растут и не дают «почти правильных» последовательностей с пропущенным звеном, которые трудно отделить от целевого продукта.
errorХимический синтез идёт в обратную сторону
Полимераза наращивает цепь в направлении 5′ → 3′, а амидофосфитный синтез — в направлении 3′ → 5′, потому что на носителе закреплён 3′-конец.
edit_noteПопробуйте сами
Какая группа защищает 5′-OH нуклеозида в амидофосфитном синтезе?
expand_moreПоказать решение
Диметокситритильная группа (DMTr); её снимают кислотой в начале каждого цикла.
push_pinГлавное
ПЦР: циклы денатурации (94–98 °C), отжига праймеров (50–65 °C) и достройки термостабильной ДНК-полимеразой (72 °C) удваивают участок ДНК: после n циклов — до \(2^n\) копий. Секвенирование по Сэнгеру: небольшая добавка 2′,3′-дидезоксинуклеотидов (нет 3′-OH) обрывает достраиваемую цепь на соответствующем основании; фрагменты разной длины разделяют электрофорезом. Электрофорез: ДНК (отрицательно заряженные фосфаты) движется к аноду, короткие фрагменты — быстрее; белки в SDS-электрофорезе получают одинаковый удельный заряд и делятся по массе. Амидофосфитный синтез олигонуклеотидов (пособие Сальникова): цепь растёт от 3′ к 5′ на носителе циклами: детритилирование (кислота снимает DMTr с 5′-OH), конденсация с амидофосфитом (тетразол), кэпирование непрореагировавших 5′-OH (\(\ce{Ac2O}\)), окисление фосфита в фосфат (\(\ce{I2}\), вода); в конце аммиак снимает защиты и отщепляет продукт. Выход — выход конденсации в степени числа присоединений.
Закрепите теорию: 8 заданий с проверкой и подсказками, урок зачитывается от 70 %.