Методы молекулярной биологии
ПЦР и секвенирование
Методы молекулярной биологии — прикладная органическая химия: всё решают 3′-OH, фосфаты и водородные связи.
Как рассуждать о ПЦР и секвенировании
- ПЦР: денатурация разделяет цепи, праймеры садятся на границы участка, полимераза достраивает от 3′-конца праймера; число копий удваивается за цикл: \(N = N_0·2^n\).
- Термостабильная полимераза (Taq из термофильной бактерии) выдерживает денатурацию — её не надо добавлять заново в каждом цикле.
- Сэнгер: ddNTP лишён 3′-OH — к нему нельзя присоединить следующий нуклеотид, цепь обрывается; по длинам оборванных фрагментов читают последовательность.
- Праймер задаёт начало синтеза; его 3′-конец должен быть комплементарен матрице.
Примеры
1. 30 циклов ПЦР с одной молекулы: до \(2^{30} ≈ 10^9\) копий.
2. Сэнгер с ddATP: фрагменты обрываются напротив каждого T матрицы.
errorПолимераза удлиняет только 3′-конец
Новые нуклеотиды присоединяются к 3′-OH растущей цепи, поэтому синтез идёт 5′ → 3′, а праймер без свободного 3′-OH не работает.
edit_noteПопробуйте сами
Сколько копий получится из 100 молекул за 10 идеальных циклов ПЦР?
expand_moreПоказать решение
\(100 · 2^{10} ≈ 1{,}0·10^5\).
Электрофорез и синтез олигонуклеотидов
Праймеры для ПЦР синтезируют химически — циклами из четырёх реакций на твёрдом носителе.
Как считать синтез и разделение
- Электрофорез: ДНК движется к аноду (+); чем короче фрагмент, тем быстрее; белки в SDS — по массе.
- Амидофосфитный синтез идёт от 3′ к 5′: 3′-концевой нуклеозид пришит к носителю, каждый цикл добавляет один нуклеотид к 5′-OH.
- Цикл: детритилирование (дихлоруксусная кислота) → конденсация с 5′-DMTr-нуклеозид-3′-амидофосфитом (тетразол) → кэпирование (\(\ce{Ac2O}\)) → окисление (\(\ce{I2}\), вода, пиридин).
- Выход: олигонуклеотид из n звеньев требует n − 1 конденсаций; выход = (выход конденсации)ⁿ⁻¹.
- Защиты оснований: бензоил (A, C), изобутирил (G), тимин без защиты; в конце — концентрированный аммиак.
Примеры
1. 20-звенный праймер при выходе конденсации 99 %: \(0{,}99^{19} = 0{,}83\) — 83 %.
2. Кэпирование нужно, чтобы цепи с пропущенным звеном не росли дальше и не давали «почти правильных» последовательностей.
errorХимический синтез идёт в обратную сторону
Полимераза наращивает цепь 5′ → 3′, а амидофосфитный синтез — 3′ → 5′: на носителе закреплён 3′-конец.
edit_noteПопробуйте сами
Какая группа защищает 5′-OH нуклеозида в амидофосфитном синтезе?
expand_moreПоказать решение
Диметокситритил (DMTr).
push_pinГлавное
ПЦР: циклы денатурации (94–98 °C), отжига праймеров (50–65 °C) и достройки термостабильной ДНК-полимеразой (72 °C) удваивают участок ДНК: после n циклов — до \(2^n\) копий. Секвенирование по Сэнгеру: небольшая добавка 2′,3′-дидезоксинуклеотидов (нет 3′-OH) обрывает достраиваемую цепь на соответствующем основании; фрагменты разной длины разделяют электрофорезом. Электрофорез: ДНК (отрицательно заряженные фосфаты) движется к аноду, короткие фрагменты — быстрее; белки в SDS-электрофорезе получают одинаковый удельный заряд и делятся по массе. Амидофосфитный синтез олигонуклеотидов (пособие Сальникова): цепь растёт от 3′ к 5′ на носителе циклами: детритилирование (кислота снимает DMTr с 5′-OH), конденсация с амидофосфитом (тетразол), кэпирование непрореагировавших 5′-OH (\(\ce{Ac2O}\)), окисление фосфита в фосфат (\(\ce{I2}\), вода); в конце аммиак снимает защиты и отщепляет продукт. Выход — выход конденсации в степени числа присоединений.
Закрепите теорию: 8 заданий с проверкой и подсказками, урок зачитывается от 70 %.