Потенциал покоя: откуда у клетки напряжение на мембране

Внутри каждой клетки вашего тела потенциал ниже, чем снаружи, примерно на семьдесят милливольт. Это напряжение кажется ничтожным, но приложено оно к плёнке толщиной в пять нанометров, и поле в ней в несколько раз сильнее того, при котором пробивается сухой воздух. Поддерживать его дорого: натрий-калиевые насосы, от которых оно зависит, расходуют от 19 до 28 % всего АТФ, образующегося в организме млекопитающего в покое. Называется это напряжение потенциалом покоя.

История этого напряжения началась с лягушачьих лапок и знаменитого спора XVIII века, а закончилась атомными структурами белков, за которые вручали Нобелевские премии. Ниже мы проследим её и по ходу разберёмся, откуда напряжение берётся: понадобятся только школьные представления об ионах и зарядах. Что происходит, когда покой нарушается, рассказано в статье «Потенциал покоя и потенциал действия», а здесь речь пойдёт о самом покое, и он окажется намного интереснее, чем обещает его имя.

• 1. Что такое потенциал покоя
• 2. Лягушки, гальванометр и спор о токе покоя
• 3. Мембрана: очень тонкий изолятор
• 4. Два разных раствора по обе стороны
• 5. Как возникает напряжение: шаг за шагом
• 6. Уравнение Нернста: сколько милливольт даёт градиент
• 7. Догадка Бернштейна
• 8. Кальмар и стеклянный электрод: потенциал наконец измерен
• 9. Почему не −89 мВ: натрий и хлорид
• 10. Каналы утечки и загадка селективности
• 11. Натрий-калиевый насос
• 12. Что будет, если насос остановится
• 13. Яды и лекарства, бьющие по насосу
• 14. Потенциал покоя у разных клеток
• 15. Зачем клетке потенциал покоя
• 16. Калий в крови
• 17. Как его измеряют сегодня
• 18. Частые вопросы
• 19. Что нужно знать для ЕГЭ
• 20. Для олимпиад
• Задания с разбором
• Литература

1. Что такое потенциал покоя

Возьмём живую клетку и два электрода, соединённые с чувствительным вольтметром. Один электрод опустим в раствор вокруг клетки, а другой — тончайшую стеклянную трубочку — будем подводить к клетке. Пока кончик снаружи, прибор показывает ноль: в любой точке раствора потенциал одинаков. Как только кончик проколет мембрану, показание скачком меняется до −70 милливольт и остаётся таким столько, сколько клетка живёт и не возбуждается.

Слова «потенциал покоя» могут ввести в заблуждение: это не потенциал какой-то одной точки, а разность потенциалов, то есть обычное электрическое напряжение. Просто в физиологии так сложилось исторически. У нейронов млекопитающих он обычно составляет от −60 до −75 мВ, у волокон скелетных мышц и клеток желудочков сердца — от −80 до −90 мВ. Мы будем считать типичным значением −70 мВ [1].

Много ли это? Семь сотых вольта не производят впечатления, пока мы не вспомним, что напряжённость электрического поля зависит ещё и от расстояния. Толщина мембраны около 5 нм, и поле в ней

E = U / d = 0,07 В / (5 · 10⁻⁹ м) = 1,4 · 10⁷ В/м.

Это 14 миллионов вольт на метр. Сухой воздух пробивается примерно при 3 миллионах вольт на метр. Мембрана выдерживает поле почти в пять раз сильнее, и такое поле способно сдвигать заряженные участки белков. Как раз так работают потенциал-зависимые каналы: заряженные спирали внутри них перемещаются при изменении напряжения.

И ещё одно: «покой» не значит бездействие. Через мембрану постоянно идут встречные потоки ионов, а белки-насосы непрерывно их компенсируют, расходуя АТФ. Постоянным напряжение остаётся потому, что эти потоки уравновешены: это стационарное состояние, а не равновесие. К этому мы вернёмся в разделе 11.

2. Лягушки, гальванометр и спор о токе покоя

Первая глава истории хорошо известна. В 1780-х годах болонский врач и анатом Луиджи Гальвани заметил, что препарат лягушачьих лапок сокращается при контакте с металлом, и в 1791 году опубликовал трактат об «электрических силах при мышечном движении». По его мнению, электричество вырабатывается самой тканью. Его соотечественник, физик Алессандро Вольта, возражал: ток возникает в месте контакта разных металлов, а лапка — лишь чувствительный индикатор. Развивая своё возражение, Вольта в 1800 году построил первый источник постоянного тока — вольтов столб.

Менее известно, что Гальвани и его сторонники (среди них племянник Джованни Альдини) нашли ответ, который мог бы примирить стороны. В опыте 1794 года лапка сокращалась вообще без металла: достаточно было прикоснуться к мышце перерезанным концом нерва. Значит, между повреждённым и неповреждённым участками живой ткани действительно существует разность потенциалов [3]. Сегодня мы знаем, что этот ток повреждения возникает благодаря потенциалу покоя. Но измерить её в то время было нечем, а авторитет Вольты и его столба затмил этот результат.

Прибор появился к 1820–1830-м годам: гальванометр. В 1842 году итальянец Карло Маттеуччи показал ток между разрезом мышцы и её неповреждённой поверхностью и придумал остроумный индикатор: нерв одной лапки клали на мышцу другой, и при сокращении второй вздрагивала и первая. Ток повреждения от этого опыта уже нельзя было списать на металлы [3].

Работу Маттеуччи молодому берлинскому физиологу Эмилю Дюбуа-Реймону дал прочитать его учитель Иоганнес Мюллер. Дюбуа-Реймон навёл порядок в методике: он намотал гальванометр с невероятным по тем временам числом витков, избавился от контактных токов на электродах, — и зарегистрировал устойчивый ток в покоящихся нервах и мышцах. Он назвал его Ruhestrom, «ток покоя». При раздражении этот ток резко ослабевал — «отрицательное колебание», как мы теперь знаем, потенциал действия. Дюбуа-Реймон был человеком с большим артистизмом: он публично демонстрировал, как отклоняется стрелка, если напрячь мускулы собственной руки, и с удовольствием писал об этом Александру фон Гумбольдту, замечая, что руки у него сильные [4].

3. Мембрана: очень тонкий изолятор

Чтобы электрическое напряжение могло существовать, нужно нечто, разделяющее заряды. В клетке это плазматическая мембрана — двойной слой липидов. Их углеводородные «хвосты» образуют внутреннюю, неполярную часть толщиной около 3 нм, куда заряженному иону попасть крайне невыгодно: в воде он окружён молекулами-диполями, а здесь лишился бы их. Поэтому для ионов липидный слой почти непроницаем и работает как электрический изолятор.

Удивительно, что толщину этой плёнки оценили задолго до того, как увидели её в электронный микроскоп, — и оба раза в 1925 году. Американец Хьюго Фрике измерил ёмкость суспензии эритроцитов на переменном токе: мембрана вела себя как обкладки конденсатора, а ёмкость 0,81 мкФ/см² соответствовала слою толщиной примерно 3 нм [6]. В том же году голландцы Эверт Гортер и Франсуа Грендель экстрагировали липиды из эритроцитов и растянули их монослоем на поверхности воды: площадь оказалась примерно вдвое больше общей поверхности клеток. Так возникла идея двойного слоя [7]. Сами они, как выяснилось позже, допустили две ошибки, частично скомпенсировавшие друг друга, но вывод оказался верным.

Раз мембрана — изолятор между двумя проводящими растворами, она и есть конденсатор с ёмкостью около 1 мкФ на квадратный сантиметр. Отсюда сразу следует простой и важный расчёт: сколько зарядов нужно, чтобы создать напряжение 70 мВ?

Q = CU = 10⁻⁶ Ф/см² · 0,07 В = 7 · 10⁻⁸ Кл/см².

Поделим на заряд одного иона (1,6 · 10⁻¹⁹ Кл) и получим 4,4 · 10¹¹ ионов на квадратный сантиметр, или около 4400 ионов на квадратный микрометр. Для клетки диаметром 10 мкм с поверхностью 314 мкм² это примерно 1,4 миллиона ионов. А всего ионов калия в такой клетке при концентрации 140 ммоль/л примерно 44 миллиарда. Для создания потенциала покоя достаточно, чтобы через мембрану перешёл один ион из тридцати с лишним тысяч.

Отсюда вывод, который нужно запомнить, потому что он разрушает самое распространённое заблуждение: цитоплазма в целом электронейтральна. Клетка не заряжена отрицательно «как целое». Лишние анионы собраны в слое у внутренней поверхности мембраны, а лишние катионы — у наружной. Толщина этого слоя в растворе с концентрацией солей как в организме меньше 1 нм. Отойдя от мембраны на несколько нанометров, вы увидите обычный нейтральный раствор: положительных и отрицательных зарядов там поровну с точностью до тысячных долей процента.

4. Два разных раствора по обе стороны

Мембрана делит пространство на две области, состав которых разительно отличается. Типичные значения для нейрона млекопитающего [1, 8]:

Цитоплазма — это раствор калия, а межклеточная жидкость — раствор поваренной соли. В теле взрослого человека около 98 % всего калия находится внутри клеток и только около 2 % — снаружи [9]. Заряд калия внутри уравновешен в основном крупными анионами: белками, нуклеиновыми кислотами, органическими фосфатами. Каналов для них нет, и они заперты в клетке. Заряд натрия снаружи уравновешен в основном хлоридом.

Запомним из этой таблицы три вещи. Во-первых, концентрации действительно сильно отличаются, и это первое условие. Во-вторых, различие создано не само собой: его поддерживает специальный насос (раздел 11). В-третьих, оба раствора электронейтральны, а потому только из разности концентраций напряжение ещё не появится. Нужно второе условие: чтобы мембрана пропускала одни ионы лучше других.

Почему же клетка наполнена именно калием, хотя натрия в морях и рассолах намного больше? Точного ответа нет, но есть важные наблюдения. Рибосомы и многие ферменты нуждаются именно в ионах калия [12]. Калий внутри клетки встречается у организмов всех доменов жизни, и по одной из гипотез первые клетки возникли в среде, где калия было больше натрия, например в геотермальных водоёмах [13]. Эта гипотеза остаётся предметом споров, но сам факт поразителен: любая клетка тратит энергию, чтобы хранить внутри состав, совсем не похожий на окружающий.

5. Как возникает напряжение: шаг за шагом

Проделаем мысленный эксперимент. Отгородим мембраной два нейтральных раствора: слева много K⁺ и столько же крупных анионов, справа K⁺ мало. Пусть вначале в мембране нет каналов. Вольтметр показывает ноль: заряды нигде не разделены, хотя концентрации совершенно разные.

Теперь откроем в мембране каналы, пропускающие только ионы калия. Ионы движутся хаотично и пересекают канал в обе стороны, но слева их намного больше, поэтому слева направо их проходит больше, чем обратно. Это обычная диффузия: никакая сила их не толкает, просто их там больше. Анионы пройти не могут. Что получается? Каждый вышедший K⁺ уносит положительный заряд и оставляет слева непарный анион. Слева появляется избыток минуса, справа — плюса. И с этого момента на ион начинает действовать уже настоящая сила: электрическое поле, направленное так, что оно тянет катионы обратно.

Чем больше калия вышло, тем сильнее поле и тем труднее выходить следующим ионам. При определённом напряжении поток наружу, вызванный разностью концентраций, точно сравняется с потоком внутрь, вызванным полем. Суммарный поток прекратится. Это напряжение называется равновесным потенциалом данного иона; для калия при наших концентрациях он равен −89 мВ.

Обратите внимание на то, как это похоже на саморегуляцию. Если напряжение почему-либо меньше равновесного, калий выходит и увеличивает его. Если больше — калий входит и уменьшает. Сама система приходит к этому значению и удерживает его.

Сколько времени занимает этот процесс? Очень мало. Перенос заряда в конденсаторе идёт с постоянной времени τ = RC, где R — сопротивление мембраны, C — её ёмкость. При типичных значениях 1 кОм·см² и 1 мкФ/см² это 1 миллисекунда. За несколько миллисекунд напряжение устанавливается, а концентрации за это время практически не меняются — мы уже подсчитали, что для этого нужна примерно тридцатитысячная доля всех ионов.

6. Уравнение Нернста: сколько милливольт даёт градиент

Найдём значение равновесного потенциала количественно. Это проще, чем кажется, если рассуждать через энергию. Посчитаем изменение энергии Гиббса при выходе одного моля ионов калия из клетки. Оно складывается из двух частей:

• концентрационная составляющая: при переходе из области большей концентрации в область меньшей энергия Гиббса уменьшается на величину RT ln([K]_вн/[K]_сн);
• электрическая составляющая: при переносе заряда zF на моль против разности потенциалов U энергия увеличивается на −zFU. Для катиона, выходящего из отрицательно заряженной клетки, это положительная величина: нужно затратить работу.

Вот как это выглядит при наших концентрациях калия и разных напряжениях (37 °C):

Равновесие наступает там, где сумма равна нулю:

RT ln([K]_сн/[K]_вн) − zFU = 0, откуда E_K = (RT/zF) ln([K]_сн/[K]_вн).

Это уравнение Нернста. При 37 °C величина RT/F равна 26,7 мВ, а после перехода к десятичному логарифму получается удобная формула для однозарядного иона:

E = (61,5 мВ / z) · lg(c_сн / c_вн).

Читается она очень просто: каждое десятикратное различие концентраций даёт 61,5 мВ. Подставим числа из таблицы раздела 4:

• калий: E_K = 61,5 · lg(5/140) = 61,5 · (−1,447) = −89 мВ;
• натрий: E_Na = 61,5 · lg(145/12) = 61,5 · 1,082 = +67 мВ;
• хлорид (z = −1): E_Cl = −61,5 · lg(110/7) = −74 мВ;
• кальций (z = 2): E_Ca = 30,75 · lg(2/0,0001) = +132 мВ.

Это уравнение имеет любопытный физический смысл. Отношение концентраций по разные стороны мембраны в равновесии — это распределение Больцмана: ионов больше там, где их энергия ниже. Поэтому в уравнении стоит RT, а температура входит в него прямо. Чем больше тепловое движение, тем большее напряжение нужно, чтобы удерживать ионы от выравнивания.

7. Догадка Бернштейна

Юлиус Бернштейн был учеником Дюбуа-Реймона и работал у Гельмгольца. Ещё в 1868 году он построил механический прерыватель — дифференциальный реотом — и впервые восстановил форму и длительность потенциала действия: раздражение повторялось тысячи раз, а прибор снимал сигнал по малым отрезкам времени [16]. Но главную свою работу он опубликовал в 1902 году, в 63 года, будучи профессором в Галле.

Его статья называлась «Исследования по термодинамике биоэлектрических токов» [17]. Идея была такой. Живая клетка окружена мембраной, которая в покое пропускает главным образом ионы калия. Внутри клетки калия намного больше, чем снаружи. Тогда по формуле Нернста на мембране должно возникать напряжение со знаком «минус» внутри. При возбуждении мембрана на мгновение теряет избирательность, начинает пропускать все ионы, и напряжение падает до нуля, — это и есть отрицательное колебание Дюбуа-Реймона.

Теория примиряла стороны старого спора. Предсуществование: да, потенциал есть и в неповреждённой клетке. Но разрез нужен, чтобы подключиться к внутренней среде. В сущности Бернштейн считал, что только дал новую интерпретацию идее своего учителя [5].

Как проверить такую гипотезу, не имея возможности измерить концентрации в клетке и поместить туда электрод? Бернштейн нашёл изящный ход. Уравнение Нернста утверждает, что напряжение пропорционально абсолютной температуре. Он нагревал и охлаждал препарат в широком интервале, приблизительно от 0 до 36 °C, и измерял напряжение повреждения. Напряжение менялось примерно так, как требовала формула. Для 1902 года это был очень сильный довод: биологический объект подчинялся термодинамическому закону [17, 16]. При нагревании от 7 до 37 °C потенциал должен вырасти на 11 % — эту величину можно было обнаружить даже гальванометром того времени.

8. Кальмар и стеклянный электрод: потенциал наконец измерен

Почти сорок лет теорию Бернштейна считали правдоподобной, но проверить напрямую не могли: большинство клеток настолько малы, что электрод в них не вставишь. Выручил моллюск. В 1936 году английский зоолог Джон Захари Янг показал, что толстые трубки в мантии кальмара, которые прежде часто принимали за кровеносные сосуды, — это гигантские нервные волокна диаметром до миллиметра [19]. Кальмару они нужны, чтобы одновременно сократить всю мантию и резко выбросить струю воды, а физиологам — потому что в такое волокно можно ввести проволоку.

Летом 1939 года в морской лаборатории в Плимуте Алан Ходжкин и двадцатиоднолетний Эндрю Хаксли, его бывший ученик, ввели в аксон кальмара вдоль его оси тонкий стеклянный капилляр с раствором соли. Это была первая прямая запись напряжения изнутри живого нервного волокна. Спор Дюбуа-Реймона и Германа кончился: внутри неповреждённого аксона потенциал ниже, чем снаружи, примерно на 45 мВ, и никакого разреза для этого не нужно [20, 21]. А при импульсе напряжение не просто падало до нуля, как думал Бернштейн, а заходило на +40 мВ. Этот «перелёт» объяснить теорией Бернштейна было нельзя. Они отправили короткую заметку в журнал Nature, и вскоре началась война: Ходжкин занялся бортовыми радарами, Хаксли — расчётами для морской артиллерии. Работу они смогли продолжить только после войны [22].

В те же годы по другую сторону океана Кеннет Коул и Говард Кертис провели похожие опыты на аксонах кальмара в Вудс-Хоуле. В 1942 году они показали ключевую вещь для потенциала покоя: при повышении концентрации KCl снаружи напряжение уменьшается, и в области больших концентраций именно так, как предсказывает уравнение Нернста [23].

Но как быть с обычными клетками, размером в десятки микрометров? Здесь история заслуживает особого рассказа. Учебники обычно приписывают изобретение стеклянного микроэлектрода Гилберту Лингу и Ральфу Джерарду, опубликовавшим в 1949 году значение −78 мВ для мышцы лягушки [24]. Подробное историческое исследование 2017 года показало, что это несправедливо [25]. Тонкие стеклянные капилляры как внутриклеточные электроды применяли ещё с 1920-х годов, преимущественно на растениях и амёбах. На мышечные волокна позвоночных метод перенесла в 1942 году Джудит Грэм, аспирантка Джерарда, получившая до −75 мВ, а в более поздних опытах с более тонкими кончиками — около −80 мВ [26, 25]. Заполнять капилляр концентрированным 3 М раствором KCl стали Уильям Настук и Ходжкин, и значение для мышцы лягушки достигло почти −90 мВ [27].

Теперь Бернштейна можно было проверить строго. Классическую проверку провели в 1959 году Ходжкин и Пол Хоровиц: они меняли концентрацию калия вокруг одиночного мышечного волокна лягушки, заменив внешний хлорид на непроникающий анион [29]. Результат показан на рисунке. В области больших концентраций калия получается идеальная прямая Нернста: 58 мВ на каждое десятикратное изменение при 20 °C. А вот при концентрациях, близких к естественным, потенциал ложится заметно выше этой прямой. Бернштейн оказался прав почти, но не совсем.

9. Почему не −89 мВ: натрий и хлорид

Рассчитанный равновесный потенциал калия равен −89 мВ, а измеренный у нейрона — около −70 мВ. Откуда разница в 19 мВ? Дело в том, что мембрана пропускает не только калий. Натрия пропускается мало, но для него и концентрация, и поле направлены в клетку, поэтому он входит и «оттягивает» напряжение в положительную сторону.

Представим состояние, когда напряжение постоянно. Значит, суммарный ток через мембрану равен нулю: выходящий ток калия уравновешен входящим током натрия. Ток каждого иона по закону Ома пропорционален его движущей силе — разности между фактическим напряжением и равновесным потенциалом иона: I = g(U − E), где g — проводимость мембраны для этого иона.

g_K(U − E_K) + g_Na(U − E_Na) = 0, откуда U = (g_KE_K + g_NaE_Na) / (g_K + g_Na).

Это, возможно, самая важная формула в статье. Она говорит: мембранный потенциал — среднее из равновесных потенциалов, взвешенное по проводимостям. Чем больше проводимость для иона, тем ближе потенциал к его равновесному значению. Пусть натриевая проводимость в покое составляет 0,14 от калиевой:

U = (−89 + 0,14 · 67) / (1 + 0,14) = −79,6 / 1,14 = −70 мВ.

При этом движущие силы очень неравны: у калия всего 19 мВ (−70 − (−89)), у натрия целых −137 мВ (−70 − 67). Поэтому небольшая проводимость для натрия и большая для калия дают одинаковые по величине токи: 0,14 · 137 = 19.

Более точное уравнение вывел в 1943 году Дэвид Гольдман для мембраны с постоянным полем внутри [30], а в 1949 году его применили к клетке Ходжкин и Бернард Кац [31]. Уравнение Гольдмана — Ходжкина — Каца выражено через проницаемости P, которые, в отличие от проводимостей, не зависят от концентраций:

U = 61,5 · lg((P_K[K]_сн + P_Na[Na]_сн + P_Cl[Cl]_вн) / (P_K[K]_вн + P_Na[Na]_вн + P_Cl[Cl]_сн)) мВ.

Концентрации хлорида переставлены местами, потому что его заряд отрицателен. Для покоящегося аксона кальмара Ходжкин и Кац получили P_K : P_Na : P_Cl = 1 : 0,04 : 0,45 [31]. Подставим эти отношения и концентрации из раздела 4:

U = 61,5 · lg((5 + 0,04 · 145 + 0,45 · 7) / (140 + 0,04 · 12 + 0,45 · 110)) = 61,5 · lg(13,95 / 190) = −70 мВ.

Мембрана в покое пропускает калий в 25 раз лучше натрия. А что будет, если это отношение изменить? График ниже показывает, как потенциал зависит от него, и в нём уже заключён весь потенциал действия: стоит на долю миллисекунды открыть натриевые каналы, и та же мембрана, с теми же растворами, оказывается в совершенно другой точке кривой.

Отметим и роль хлорида. В нейронах его равновесный потенциал близок к потенциалу покоя, поэтому большого тока он в покое не создаёт, но сильно стабилизирует напряжение: любое отклонение от него вызывает ток хлорида, возвращающий мембрану назад. В волокнах скелетных мышц на хлорид приходится примерно 70–80 % всей проводимости покоя [32].

10. Каналы утечки и загадка селективности

Бернштейн говорил о «мембране, проницаемой для калия», а современный вопрос звучит конкретнее: что это за белки? Долгое время калиевые каналы, открытые в покое, были известны только как «ток утечки» — фон, который вычитали из записи при изучении интересных сигналов. Их обнаружили только в 1990-х годах: сначала у дрожжей [35], а в 1996 году — у человека [36]. Это двупоровые калиевые каналы (K2P): они почти не зависят от напряжения и открыты и при потенциале покоя. У человека их 15 генов, и работа этих каналов тонко регулируется температурой, кислотностью, растяжением мембраны и жирными кислотами [37]. Значит, потенциал покоя — настраиваемая величина.

Постоянный вход натрия тоже имеет своего белка-виновника. В 2007 году установили, что значительную часть фонового натриевого тока нейронов создаёт неселективный канал NALCN. Мыши, лишённые этого гена, умирают в первые сутки жизни с нарушенным дыхательным ритмом [38]. Малая «утечка», которую легко было счесть дефектом мембраны, оказалась необходимой для работы дыхательного центра.

Самое удивительное свойство калиевых каналов — их разборчивость. Они пропускают порядка десятков миллионов ионов K⁺ в секунду, что близко к пределу диффузии, и при этом отличают его от Na⁺ в тысячу и более раз [39]. Почему это странно? Потому что ион Na⁺ меньше иона K⁺: радиусы 1,02 и 1,38 Å. Отверстие, пропускающее больший ион, пропускает и меньший, — по крайней мере, так подсказывает здравый смысл. И как может канал быть одновременно очень разборчивым (что требует сильного связывания) и очень быстрым (что требует слабого)?

Ответ получил Родерик Маккиннон. Врач по образованию, он сменил профессию и в 1998 году опубликовал кристаллическую структуру бактериального калиевого канала KcsA [40], за что получил Нобелевскую премию по химии 2003 года. В самом узком месте канала находится селективный фильтр: четыре кольца атомов кислорода от карбонильных групп белкового остова. В воде ион окружён гидратной оболочкой, и чтобы войти в фильтр, он должен с ней расстаться. Энергия гидратации велика (около −295 кДж/моль для K⁺ и −365 кДж/моль для Na⁺ [41]). Для калия кольца кислородов расположены так, что заменяют молекулы воды почти идеально, и потеря окупается. Для натрия, который держит воду крепче, такая замена оказывается менее выгодной [42].

Важная оговорка: модель «жёсткой подогнанной поры» не вся правда. Расчёты показали, что атомы фильтра при тепловом движении смещаются на величину, сравнимую с разницей радиусов и даже большую, и селективность создают ещё и сильное электростатическое взаимодействие между карбонилами, и их плотная упаковка [43]. А скорость проведения объясняется тем, что в фильтре находятся сразу несколько ионов калия, которые отталкиваются друг от друга: вход нового иона выталкивает ион с другого конца [44].

11. Натрий-калиевый насос

До сих пор мы рассуждали так, будто разность концентраций дана нам от природы. Но раз натрий постоянно входит, а калий выходит, разность должна исчезать. Значит, что-то поддерживает её, причём с затратой энергии. Догадались об этом давно: в начале 1940-х годов стало ясно, что натрий проходит через мембрану мышцы, и в 1941 году Роберт Дин предположил существование «насоса» [45].

Прямое доказательство получили Ходжкин и Ричард Кейнс в 1955 году. Они вводили в гигантский аксон радиоактивный натрий и наблюдали, как он выходит наружу. Динитрофенол, блокирующий синтез АТФ, прекращал этот выход, а после отмывания яда он возобновлялся. Выброс натрия зависел и от наружного калия: значит, эти два потока сопряжены [46]. Через пять лет показали, что отравленному аксону возвращает способность выбрасывать натрий инъекция самой АТФ [47].

За один цикл натрий-калиевая АТФаза выводит из клетки три иона Na⁺ и вводит два иона K⁺, гидролизуя одну молекулу АТФ [49]. Цикл идёт порядка ста раз в секунду. Для сравнения: через один открытый канал за то же время проходят десятки миллионов ионов. Разница огромна, но принципиальная схема близка: насос, как заметил Дэвид Гэдсби, похож на канал с двумя воротами, которые никогда не бывают открыты одновременно [50]. Атомные структуры этого белка, полученные с 2007 года, показали, как именно это устроено [51, 52, 53].

Хватит ли энергии АТФ на такую работу? Посчитаем её так же, как для калия в разделе 6, при −70 мВ и 37 °C. Вывод 1 моль Na⁺ наружу идёт и против концентрации, и против поля: 6,4 + 6,8 = 13,2 кДж. Ввод 1 моль K⁺ внутрь идёт против концентрации, но по полю: 8,6 − 6,8 = 1,8 кДж. На цикл:

3 · 13,2 + 2 · 1,8 = 43 кДж на моль циклов.

Гидролиз моля АТФ в условиях клетки даёт 50–60 кДж. Значит, насос использует примерно три четверти энергии и работает недалеко от термодинамического предела.

Какова роль насоса в создании напряжения? Здесь важно не ошибиться. Часто утверждают, что потенциал покоя «создаётся насосом». Это верно только косвенно. Прямой вклад насоса связан с тем, что наружу он выносит на один положительный заряд больше, чем вносит: он электрогенен [54]. Но этот вклад мал. Учесть его позволяет уравнение Маллинза — Ноды [55], в котором калиевые члены умножают на коэффициент 3/2. Для наших концентраций при P_Na/P_K = 0,04 оно даёт −74 мВ против −69 мВ без учёта насоса: прибавка около 5 мВ. Основную часть напряжения создаёт калий, вытекающий по каналам. Роль насоса — поддерживать концентрации, которые это делают возможным.

Цена такой конструкции велика. В покое Na⁺/K⁺-АТФаза потребляет 19–28 % всего АТФ, образуемого в организме млекопитающего [56]. Головной мозг человека составляет около 2 % массы тела и потребляет около 20 % кислорода [57], и большая часть энергии его сигнальных процессов уходит на то, чтобы насосы вернули ионы после импульсов и синаптических токов. На поддержание самого потенциала покоя в сером веществе у грызунов, по оценке Эттвелла и Лафлина, приходится около 13 % энергии, связанной с передачей сигналов [58].

Есть у насоса и не менее важная вторая работа: он не даёт клетке лопнуть. Внутри клетки заперты крупные анионы, а малые ионы могут проходить через мембрану. Такая система стремится к равновесию Доннана (Фредерик Доннан, 1911 год [59]), при котором внутри суммарная концентрация частиц всегда выше, чем снаружи. Вода по осмосу входила бы в клетку без остановки, и клетка животного, не имеющая жёсткой стенки, в конце концов разорвалась бы. Насос решает эту задачу так: выводя натрий, он делает его практически непроникающим, и натрий снаружи уравновешивает заряд и осмотическое давление белков внутри. Эту модель сформулировали в 1960 году Даниэль Тостесон и Джозеф Хоффман [60]; расчёт для равновесия Доннана есть в разделе 20.

12. Что будет, если насос остановится

Ответ зависит от размеров клетки, и здесь есть поучительная разница. Если заблокировать насос в гигантском аксоне кальмара, ничего заметного сразу не произойдёт: он продолжит проводить импульсы [46]. Посчитаем почему. Запас натрия и калия пропорционален объёму, а поток через мембрану — площади поверхности. Для цилиндра отношение объёма к поверхности равно d/4. Ионов натрия в аксоне диаметром 500 мкм при концентрации 50 ммоль/л на 1 см² поверхности приходится 6,25 · 10⁻⁷ моль. Вход в покое составляет порядка 40 пмоль/(см²·с). Поэтому концентрация удвоится примерно за 4,3 часа. Один импульс добавляет около 3 пмоль/см² — приблизительно 0,24 мкмоль/л, то есть пятимиллионную долю исходной концентрации. Поэтому аксон с остановленным насосом может провести сотни тысяч импульсов.

А теперь уменьшим диаметр в 500 раз, до обычного для коры мозга 1 мкм. При тех же условиях тот же результат наступит через 31 секунду. В тонких аксонах и дендритах запас ничтожен. Вот почему мозг так чувствителен к остановке кровообращения.

В 2018 году группа Йенса Дрейера опубликовала записи с электродов в коре головного мозга пациентов с тяжёлым повреждением мозга, у которых прекращали поддерживающую терапию. Они показали, что после финального падения кровотока кора сначала замолкает, а через несколько минут (медиана 3,9 минуты) возникает волна терминальной деполяризации: нейроны лавинообразно теряют ионные градиенты, и волна распространяется по коре. Важно, что этот момент не означает мгновенной смерти: при восстановлении кровотока процесс на ранних стадиях ещё обратим, но запускает токсические изменения [61]. Такие данные важны для медицины реанимации и для споров о том, когда считать наступившей необратимую гибель мозга.

13. Яды и лекарства, бьющие по насосу

Когда один белок так важен для всех животных клеток, неудивительно, что растения и животные научились использовать его как мишень.

Наперстянка и сердце. Английский врач Уильям Уизеринг в 1785 году описал, как настой наперстянки лечит водянку при сердечной недостаточности; по его словам, он узнал об этом средстве от старой женщины из Шропшира. Что он действует на насос, показал лишь Ганс Шацман в 1953 году на эритроцитах [64]. Сердечные гликозиды тормозят насос, натрий внутри клетки немного накапливается, и обменник Na⁺/Ca²⁺ выводит меньше кальция. В клетке сердца становится больше кальция, и сокращение усиливается. Поэтому дигоксин и сейчас применяют при некоторых заболеваниях сердца, хотя разница между лечебной и токсической дозами мала.

Уабаин и стрелы. Родственный ему яд из растений рода акокантера использовали охотники в Восточной Африке для стрел. Один грызун использует его сам: африканский гривистый хомяк (Lophiomys imhausi) разжёвывает кору дерева Acokanthera schimperi и наносит кашицу на особые волоски в гриве. Хищник, укусивший зверька, рискует отравиться [65].

Бабочка-монарх. Гусеницы монарха едят ваточник, богатый сердечными гликозидами, и накапливают их, становясь несъедобными для птиц. Защищены они тем, что в их насосе заменено несколько аминокислот в месте связывания яда, — такие замены независимо возникали у насекомых из шести отрядов [66]. В 2019 году группа Ноа Уайтмана с помощью CRISPR внесла три такие замены (в позициях 111, 119 и 122) в ген плодовой мушки и получила «монарших мух»: они стали нечувствительны к гликозидам так же, как монархи, и даже удерживали небольшие количества яда при метаморфозе [67]. Эволюция яда и защиты от него записана буквально в нескольких аминокислотах насоса.

Палитоксин. На гавайском острове Мауи, у селения Хана, местные жители знали ядовитую «морскую траву» limu-make-o-Hana, что значит «смертельная водоросль Ханы». Ею оказался колониальный морской полип рода Palythoa, а его токсин палитоксин, выделенный в 1971 году, — самое ядовитое из известных тогда небелковых веществ: для мышей при введении в вену ЛД₅₀ равна 0,15 мкг/кг [68]. Его механизм поражает: он связывается с насосом и не даёт ему закрываться, превращая насос в открытый канал [69]. Лучшего доказательства того, что насос и канал родственны по принципу, нельзя и придумать: один токсин превращает одно в другое.

14. Потенциал покоя у разных клеток

Значения потенциала покоя сильно различаются и легко объясняются составом каналов в мембране.

Мышечные волокна и клетки желудочков сердца имеют очень большую калиевую проводимость, и их потенциал почти совпадает с E_K. Астроциты — вспомогательные клетки мозга — ведут себя почти как идеальный калиевый электрод: Стивен Каффлер и его коллеги показали это в 1966 году, и позже стало ясно, что астроциты поглощают избыток калия, вышедшего из активных нейронов [70, 71]. Эритроциты с их потенциалом около −10 мВ [72] представляют другой случай: хлоридная проводимость у них значительно больше калиевой, а хлорид там распределён почти равновесно. Потенциала действия у них нет и не требуется.

Интересны организмы, не имеющие натрий-калиевого насоса. Растения и грибы используют протонную АТФазу, выбрасывающую наружу ионы H⁺ [73]. В таких клетках насос сам создаёт основную часть напряжения, и оно очень большое: −120…−160 мВ у растений [74] и около −200 мВ у гриба нейроспоры. Клиффорд Слейман показал в 1965 году, что если блокировать дыхание, потенциал нейроспоры в течение минуты падает примерно с −200 до −30 мВ [75]. Вспомним теперь аксон кальмара, способный часами работать без насоса, и станет видно, насколько это разные системы.

Бактерии тоже имеют мембранный потенциал: у кишечной палочки он составляет от −85 до −140 мВ в зависимости от pH среды [76]. Он питает вращение жгутика и транспорт веществ. В 2011 году с помощью флуоресцентного белка-индикатора удалось увидеть, что потенциал отдельных клеток E. coli колеблется и даёт всплески с частотой до 1 Гц [77]. А в 2015 году показали, что в биоплёнках Bacillus subtilis клетки передают друг другу электрические сигналы волнами калия через калиевые каналы [78]. Похоже, электрическая сигнализация намного старше нервной системы.

В каждой животной клетке есть и вторая мембрана со своим напряжением: внутренняя мембрана митохондрий. На ней поддерживается −150…−180 мВ (матрикс отрицателен), и эту разность потенциалов создаёт не K⁺, а работа дыхательной цепи, выкачивающей протоны [79]. Вместе с разностью pH она приводит в движение АТФ-синтазу. Энергия для насоса мембраны клетки получается, таким образом, благодаря другому мембранному потенциалу.

15. Зачем клетке потенциал покоя

У нейрона ответ на этот вопрос очевиден: без потенциала покоя нет нервного импульса. Но потенциал покоя есть почти у всех клеток, в том числе у тех, что никаких импульсов не дают. Значит, он нужен не только для этого.

Готовность к импульсу. Потенциал-зависимые натриевые каналы могут открыться только из особого, «готового» состояния, в которое они возвращаются при достаточно отрицательном напряжении. Чем ближе потенциал покоя к нулю, тем меньшая их доля готова к работе (инактивация). Поэтому длительная деполяризация не облегчает, а затрудняет возбуждение.

Источник энергии для транспорта. Мы видели, что вход одного моля Na⁺ в клетку даёт 13,2 кДж. Примерно половина этой величины возникает благодаря концентрациям, а половина — благодаря полю, то есть потенциалу покоя. Эту энергию используют белки-переносчики: глюкоза, аминокислоты, многие другие вещества входят в клетку вместе с натрием. Белок SGLT1 в эпителии кишечника и почек переносит 2 иона Na⁺ на молекулу глюкозы [80]. Простой расчёт: 2 · 13,2 = 26,4 кДж на моль глюкозы. Такой энергии хватает, чтобы накопить глюкозу внутри клетки в концентрации примерно в 28 000 раз большей, чем снаружи: c_вн/c_сн = exp(26 400 / (8,314 · 310)).

Датчик обмена веществ. Как β-клетка поджелудочной железы узнаёт о том, что в крови много глюкозы? Через потенциал покоя. Его поддерживают особые калиевые каналы, которые закрываются при росте концентрации АТФ [82].

Открытие этого механизма имело неожиданное следствие для пациентов. Некоторые дети с неонатальным сахарным диабетом имеют мутацию гена KCNJ11, из-за которой эти каналы не закрываются даже при обилии АТФ [83]. Эти дети с младенчества получали инъекции инсулина, хотя сами их β-клетки целы и инсулин есть: они просто «не слышат» сигнала. Препараты сульфонилмочевины закрывают такой канал другим путём. В исследовании 2006 года 44 из 49 пациентов (90 %) смогли полностью отказаться от инъекций и перейти на таблетки [84]. Редкий случай, когда понимание потенциала покоя буквально изменило жизнь людей.

Защита яйцеклетки. Яйцеклетка морского ежа в покое имеет потенциал около −70 мВ. Как только в неё входит первый сперматозоид, открываются натриевые каналы, и за секунды потенциал становится положительным. Лауринда Джаффе показала в 1976 году, что положительный потенциал сам по себе препятствует слиянию со следующими сперматозоидами: если искусственно удерживать напряжение отрицательным, наблюдается полиспермия, а если положительным — оплодотворения не происходит [85].

Управление ростом и делением. Быстро делящиеся клетки, в том числе многие опухолевые, обычно деполяризованы по сравнению с покоящимися клетками той же ткани [86]. Механизм начали понимать недавно: в 2015 году показали, что деполяризация меняет расположение отрицательно заряженных липидов в мембране и усиливает сигнальный путь белка K-Ras, отвечающего за деление клетки [87]. То есть потенциал покоя также передаёт клетке сообщения о её состоянии.

Сон, наркоз, слух. Несколько примеров показывают, как широка эта тема. Летучие анестетики активируют двупоровые калиевые каналы TASK и TREK-1, и нейроны становятся более отрицательными: это один из предполагаемых механизмов наркоза [88]. В 2016 году на мышах показали, что при пробуждении концентрация калия вне клеток мозга растёт, а во сне падает, причём изменение ионного состава снаружи само по себе может перевести кору из режима сна в режим бодрствования [89]. А у волосковых клеток внутреннего уха картина перевёрнута: их верхушка омывается эндолимфой, где калия много (около 150 ммоль/л), а потенциал равен примерно +80 мВ. Разность напряжений составляет порядка 150 мВ, и ток возбуждения в этих клетках несёт калий, входящий внутрь. Такое устройство делает ухо быстрым и экономным: насос здесь работает на удалении от рецептора [90].

16. Калий в крови

Вернёмся к уравнению Нернста и посмотрим, какая концентрация особенно важна. Наружная концентрация калия мала, поэтому небольшие абсолютные изменения меняют её сильно. Внутренняя велика, и она почти не меняется. Сравним:

• повышение наружного калия с 5 до 10 ммоль/л (на 5 ммоль/л) сдвигает E_K на 61,5 · lg 2 = +18,5 мВ;
• такое же уменьшение внутреннего — с 140 до 135 ммоль/л — сдвигает его всего на 1 мВ.

Поэтому концентрация калия в плазме крови поддерживается в узких пределах: от 3,5 до 5 ммоль/л [9]. Выйти из них опасно, и причина — в потенциале покоя. Если подсчитать, сколько калия вокруг клеток во всём теле, получится около 70 ммоль. Один банан содержит порядка 10 ммоль. Если бы весь калий из него остался снаружи клеток, его концентрация выросла бы примерно на 0,7 ммоль/л. Этого не происходит, потому что инсулин после еды быстро усиливает работу насоса, загоняя калий внутрь клеток, а затем почки выводят избыток [9].

При гиперкалиемии (например, при почечной недостаточности) мембрана клеток сердца деполяризуется. Сначала возбудимость растёт, потому что мембрана ближе к порогу, а затем снижается из-за инактивации натриевых каналов: импульс проводится всё хуже, и возникает риск опасной аритмии и остановки сердца [91]. Этим же свойством пользуются хирурги: чтобы остановить сердце на время операции, в его сосуды вводят холодный раствор с повышенной концентрацией калия. Метод предложил Денис Мелроуз с соавторами в 1955 году [92], и в современных вариантах он применяется до сих пор.

При гипокалиемии ожидаешь обратного: внешнего калия меньше, по уравнению Нернста клетка должна быть отрицательнее, а значит — менее возбудима. И до определённой границы это так. Но проницаемость для калия тоже зависит от его концентрации снаружи: особые каналы при снижении внешнего калия пропускают его хуже. Натриевый вклад становится сравнительно больше, и мембрана ведёт себя парадоксально. У мышечных волокон есть два устойчивых состояния, около −85 и около −60 мВ, и при низком калии часть волокон перескакивает во второе, где они невозбудимы [93]. Это объясняет приступы мышечной слабости при наследственном гипокалиемическом периодическом параличе, а заодно показывает, что простые расчёты по уравнению Нернста — лишь первый шаг.

17. Как его измеряют сегодня

Острый микроэлектрод — стеклянный капилляр с кончиком менее 0,5 мкм, заполненный концентрированным раствором KCl. Он остаётся наиболее прямым инструментом, но у него есть недостаток: прокол создаёт в мембране небольшую утечку, и в мелких клетках потенциал получается заниженным. Это одна из причин, почему значения в ранних работах были ниже современных.

Метод локальной фиксации (пэтч-кламп). Эрвин Неер и Берт Закман в 1976 году прижали к мембране гладкий кончик пипетки и записали ток через одиночные каналы [94]. Вскоре в их лаборатории заметили, что при небольшом разрежении стекло плотно приклеивается к мембране с сопротивлением контакта в гигаомы [95]. Затем прорыв участка мембраны в пипетке даёт доступ внутрь клетки почти без утечки. Именно так сегодня записывают потенциал покоя нейронов, в том числе в мозге живых животных. За этот метод Неер и Закман получили Нобелевскую премию 1991 года.

Оптические методы. Красители и генетически закодированные белки меняют свечение в зависимости от напряжения и позволяют следить за сотнями клеток сразу, не прикасаясь к ним. Долгое время они показывали только изменения потенциала, а не его значение. Сейчас это ограничение преодолевают измерением времени жизни флуоресценции [96].

18. Частые вопросы

Внутри клетки заряд отрицательный, а калий положителен. Почему же он выходит? Поле действительно тянет калий внутрь, но разность концентраций выталкивает его сильнее. При −70 мВ вклады равны −8,6 и +6,8 кДж/моль, и итог направлен наружу, хоть и небольшой. При −89 мВ эти вклады равны, и выход прекращается.

Если натрий и поле, и концентрация тянут в клетку, почему он её не заполняет? Потому что для него в покое открыто очень мало каналов. Тот натрий, что всё же входит, насос непрерывно выводит.

Заряжена ли клетка в целом? Нет. Цитоплазма и межклеточная жидкость электронейтральны. Лишние заряды сосредоточены в слоях толщиной менее нанометра по обе стороны мембраны, а их доля — порядка одной тридцатитысячной от всех ионов.

Создаётся ли потенциал покоя насосом? Прямо — лишь на несколько милливольт. Основная часть возникает, когда калий выходит по каналам, а насос поддерживает различие концентраций, без которого этого выхода не было бы.

Если всё движение ионов уравновешено, почему нужна энергия? Уравновешен лишь электрический ток: калий выходит, натрий входит. Концентрации из-за этого медленно выравнивались бы. Энергия нужна, чтобы возвращать ионы обратно. Это стационарное состояние, а не равновесие.

Почему нельзя взять и измерить ток покоя, идущий через мембрану, вольтметром? Потому что суммарный ток равен нулю. Вольтметр измеряет напряжение, а отдельные токи определяют с помощью других методов — например, с радиоактивными метками.

Чем потенциал покоя отличается от потенциала действия? Потенциал покоя — постоянное напряжение невозбуждённой клетки. Потенциал действия — быстрое и кратковременное изменение этого напряжения вплоть до смены знака, распространяющееся по мембране (см. статью о нём).

Можно ли измерить потенциал покоя электродом на коже? Нет: мембраны миллиардов клеток ориентированы по-разному, и их поля в покое почти не складываются наружу. Электрокардиограмма и электроэнцефалограмма улавливают не сам покой, а согласованные изменения напряжения.

19. Что нужно знать для ЕГЭ

• В покое мембрана нейрона поляризована: внутренняя сторона заряжена отрицательно относительно наружной, потенциал покоя около −70 мВ.
• Ионов калия больше внутри клетки, ионов натрия — снаружи.
• Натрий-калиевый насос выводит 3 иона Na⁺ и вводит 2 иона K⁺ на одну молекулу АТФ. Это активный транспорт.
• Движение ионов по каналам по градиенту концентрации (калий наружу, натрий внутрь) — пассивный транспорт.
• В покое мембрана проницаема главным образом для калия, поэтому потенциал покоя близок к равновесному потенциалу калия.
• Если остановить насос (например, из-за нехватки АТФ при отравлении), различия концентраций постепенно исчезают, а с ними исчезает и потенциал покоя.

20. Для олимпиад

Уравнение Нернста из распределения Больцмана

В равновесии вероятность найти ион в области с потенциальной энергией W пропорциональна exp(−W/RT), если энергия выражена на моль. Для иона с зарядом z в потенциале φ W = zFφ. Отношение концентраций равно c_вн/c_сн = exp(−zF(φ_вн − φ_сн)/RT). Логарифмируя, получаем уравнение Нернста. Изменение потенциала на 26,7 мВ при 37 °C меняет отношение концентраций однозарядного иона в e раз.

Равновесие Доннана

Пусть внутри клетки заперты анионы с концентрацией A (z = −1), а снаружи раствор KCl с концентрацией c. Калий и хлорид проходят через мембрану. В равновесии обе пары подчиняются уравнению Нернста с одним и тем же U:

[K]_сн / [K]_вн = [Cl]_вн / [Cl]_сн, то есть [K]_вн[Cl]_вн = c².

Вместе с условием нейтральности [K]_вн = [Cl]_вн + A это даёт квадратное уравнение. При c = 150 и A = 100 ммоль/л [Cl]_вн = 108,1 и [K]_вн = 208,1 ммоль/л; U = 61,5 · lg(150/208,1) = −8,7 мВ. Обратите внимание: внутри 416 ммоль/л частиц, снаружи 300. Вода пойдёт внутрь, и равновесие недостижимо для клетки без жёсткой стенки. Это показывает, почему нужен насос и почему Доннан — не объяснение потенциала покоя.

Вклад насоса: уравнение Маллинза — Ноды

В стационарном состоянии вход натрия J_Na должен быть равен выводу насосом, а выход калия J_K — вводу насосом, то есть J_Na = 1,5 J_K при коэффициенте r = 3/2. Подставив эти потоки в уравнение постоянного поля, получим

U = 61,5 · lg((rP_K[K]_сн + P_Na[Na]_сн) / (rP_K[K]_вн + P_Na[Na]_вн)).

При r = 1 насос нейтрален, и это обычное уравнение Гольдмана. При r = 1,5 потенциал становится на 5 мВ отрицательнее (−73,8 вместо −68,5 мВ).

Масштаб: экранирование и время установления

Заряд у мембраны экранируется ионами раствора на расстоянии порядка дебаевской длины. При ионной силе 0,15 моль/л она равна 0,304/√0,15 = 0,78 нм. Поэтому слой избыточного заряда так тонок. Постоянная времени τ = R_мC_м не зависит от размеров клетки: ток и ёмкость пропорциональны площади, и она в формуле сокращается. У большинства клеток τ составляет от 1 до десятков миллисекунд.

Два режима уравнения Гольдмана

Поскольку при большой разнице проницаемостей натрий почти не влияет, уравнение Гольдмана удобно приближать двумя режимами. При [K]_сн ≫ (P_Na/P_K)[Na]_сн наклон зависимости U от lg[K]_сн близок к 61,5 мВ, при обратном соотношении потенциал почти не зависит от [K]_сн. Граница для наших данных: 0,04 · 145 = 5,8 ммоль/л, что близко к нормальной концентрации калия. Клетка работает как раз в переходной области, и это видно на кривой в разделе 8.

Задания с разбором

Задание 1

Выберите три верных утверждения о потенциале покоя нейрона: 1) внутренняя сторона мембраны заряжена отрицательно относительно наружной; 2) концентрация ионов калия снаружи клетки выше, чем внутри; 3) натрий-калиевый насос переносит ионы против градиента концентрации; 4) потенциал покоя близок к равновесному потенциалу калия; 5) цитоплазма в целом заряжена отрицательно; 6) в покое натриевая проводимость мембраны больше калиевой.

Задание 2

Установите последовательность событий при возникновении потенциала в мысленном опыте, начиная с момента, когда каналы ещё закрыты: 1) разделение зарядов создаёт электрическое поле; 2) открываются калиевые каналы; 3) потоки ионов калия наружу и внутрь уравниваются; 4) калий диффундирует наружу по градиенту концентрации; 5) поле начинает тормозить выход калия.

Задание 3

Найдите три ошибки: «(1) Мембрана нейрона в покое поляризована. (2) Её наружная поверхность заряжена отрицательно. (3) Потенциал покоя поддерживается за счёт разных концентраций ионов. (4) Натрий-калиевый насос выводит из клетки два иона натрия и вводит три иона калия. (5) Работа насоса требует затраты АТФ. (6) Калий выходит из клетки через каналы путём активного транспорта».

Задание 4

Рассчитайте равновесные потенциалы калия и натрия при 37 °C, если концентрации K⁺ внутри и снаружи равны 150 и 5 ммоль/л, а Na⁺ — 15 и 145 ммоль/л.

Задание 5

На сколько сместится равновесный потенциал калия при 37 °C, если: а) наружная концентрация вырастет с 5 до 10 ммоль/л; б) внутренняя уменьшится с 140 до 130 ммоль/л? Какая концентрация важнее и почему?

Задание 6

Мембрана проницаема только для K⁺ и Na⁺, причём P_Na/P_K = 0,05. Концентрации K⁺ внутри и снаружи 140 и 5 ммоль/л, Na⁺ — 12 и 145 ммоль/л. Найдите потенциал покоя при 37 °C.

Задание 7

Сферическая клетка имеет диаметр 20 мкм, потенциал покоя −80 мВ, ёмкость мембраны 1 мкФ/см², концентрация калия в цитоплазме 140 ммоль/л. Какое число ионов перешло через мембрану, чтобы создать это напряжение? Какая это доля от всех ионов калия клетки?

Задание 8

Покажите расчётом, что энергии гидролиза АТФ (55 кДж/моль) хватает на цикл насоса при 37 °C и U = −70 мВ. Концентрации: Na⁺ 12 и 145 ммоль/л (внутри и снаружи), K⁺ 140 и 5 ммоль/л. Какая доля энергии АТФ использована?

Задание 9

Бернштейн предсказал, что потенциал пропорционален абсолютной температуре. Каким будет равновесный потенциал калия лягушачьей мышцы при 7 °C, если при 37 °C он равен −89 мВ (концентрации считать неизменными)?

Задание 10

Ответьте, что произойдёт и почему: а) с потенциалом покоя нейрона при добавлении тетродотоксина, блокирующего потенциал-зависимые натриевые каналы; б) с клеткой животного через много часов после добавления уабаина.

Задание 11

Объясните, почему препараты сульфонилмочевины усиливают выделение инсулина при некоторых формах диабета, опираясь на понятие потенциала покоя.

Задание 12 (олимпиадное)

Рассчитайте потенциал покоя аксона кальмара при 20 °C (наклон 58,2 мВ) по уравнению Гольдмана — Ходжкина — Каца: K⁺ 400 и 20 ммоль/л, Na⁺ 50 и 440 ммоль/л, Cl⁻ 52 и 560 ммоль/л (внутри и снаружи), P_K : P_Na : P_Cl = 1 : 0,04 : 0,45. Сравните с E_K.

Задание 13 (олимпиадное)

Насос заблокирован, вход Na⁺ через мембрану 40 пмоль/(см²·с) не меняется. За какое время концентрация натрия удвоится (с 50 до 100 ммоль/л) в цилиндрическом аксоне диаметром: а) 500 мкм; б) 1 мкм? Какой вывод можно сделать?

Задание 14 (олимпиадное)

Внутри клетки заперты анионы с концентрацией 100 ммоль/л, снаружи — 150 ммоль/л KCl. Клетка проницаема для K⁺ и Cl⁻, объём фиксирован, 37 °C. Найдите концентрации внутри, потенциал и суммарную концентрацию частиц в обоих растворах.

Задание 15 (олимпиадное)

Используя уравнение Гольдмана — Ходжкина — Каца для K⁺ и Na⁺ (P_Na/P_K = 0,04; [K]_вн = 140, [Na]_сн = 145, [Na]_вн = 12 ммоль/л, 37 °C), найдите потенциал при концентрации калия в плазме 4 и 7 ммоль/л. Оцените по этим числам, опасно ли такое повышение для сердца, если порог возбуждения клетки желудочка находится примерно на 25 мВ положительнее потенциала покоя.

Задание 16 (олимпиадное)

Белок SGLT1 переносит 2 иона Na⁺ на молекулу глюкозы. Какое наибольшее отношение концентраций глюкозы (внутри/снаружи) он может создать при 37 °C и U = −70 мВ, если натрия внутри 12, а снаружи 145 ммоль/л? Как изменится ответ при U = −40 мВ?

Литература

1. Kandel E. R., Koester J. D., Mack S. H., Siegelbaum S. A. (eds.) Principles of Neural Science. 6th ed. McGraw-Hill, 2021.
2. Weaver J. C., Chizmadzhev Y. A. Theory of electroporation: a review. Bioelectrochem. Bioenerg. 1996, 41, 135–160.
3. Piccolino M. Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani. Brain Res. Bull. 1998, 46, 381–407.
4. Finkelstein G. Emil du Bois-Reymond: Neuroscience, Self, and Society in Nineteenth-Century Germany. MIT Press, 2013.
5. De Palma A., Pareti G. Bernstein’s long path to membrane theory: radical change and conservation in nineteenth-century German electrophysiology. J. Hist. Neurosci. 2011, 20, 306–337.
6. Fricke H. The electric capacity of suspensions with special reference to blood. J. Gen. Physiol. 1925, 9, 137–152.
7. Gorter E., Grendel F. On bimolecular layers of lipoids on the chromocytes of the blood. J. Exp. Med. 1925, 41, 439–443.
8. Hille B. Ion Channels of Excitable Membranes. 3rd ed. Sinauer, 2001.
9. Palmer B. F. Regulation of potassium homeostasis. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2015, 10, 1050–1060.
10. Ringer S. A further contribution regarding the influence of the different constituents of the blood on the contraction of the heart. J. Physiol. 1883, 4, 29–42.
11. Miller D. J. Sydney Ringer; physiological saline, calcium and the contraction of the heart. J. Physiol. 2004, 555, 585–587.
12. Rozov A., Khusainov I., El Omari K. et al. Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction. Nat. Commun. 2019, 10, 2519.
13. Mulkidjanian A. Y., Bychkov A. Y., Dibrova D. V. et al. Origin of first cells at terrestrial, anoxic geothermal fields. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, E821–E830.
14. Nernst W. Die elektromotorische Wirksamkeit der Jonen. Z. Phys. Chem. 1889, 4, 129–181.
15. Ostwald W. Elektrische Eigenschaften halbdurchlässiger Scheidewände. Z. Phys. Chem. 1890, 6, 71–82.
16. Seyfarth E.-A. Julius Bernstein (1839–1917): pioneer neurobiologist and biophysicist. Biol. Cybern. 2006, 94, 2–8.
17. Bernstein J. Untersuchungen zur Thermodynamik der bioelektrischen Ströme. Pflügers Arch. 1902, 92, 521–562.
18. Overton E. Beiträge zur allgemeinen Muskel- und Nervenphysiologie. II. Mittheilung. Pflügers Arch. 1902, 92, 346–386.
19. Young J. Z. Structure of nerve fibres and synapses in some invertebrates. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1936, 4, 1–6.
20. Hodgkin A. L., Huxley A. F. Action potentials recorded from inside a nerve fibre. Nature 1939, 144, 710–711.
21. Huxley A. From overshoot to voltage clamp. Trends Neurosci. 2002, 25, 553–558.
22. Schwiening C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. J. Physiol. 2012, 590, 2571–2575.
23. Curtis H. J., Cole K. S. Membrane resting and action potentials from the squid giant axon. J. Cell. Comp. Physiol. 1942, 19, 135–144.
24. Ling G., Gerard R. W. The normal membrane potential of frog sartorius fibers. J. Cell. Comp. Physiol. 1949, 34, 383–396.
25. Bretag A. H. The glass micropipette electrode: a history of its inventors and users to 1950. J. Gen. Physiol. 2017, 149, 417–430.
26. Graham J., Gerard R. W. Membrane potentials and excitation of impaled single muscle fibers. J. Cell. Comp. Physiol. 1946, 28, 99–117.
27. Nastuk W. L., Hodgkin A. L. The electrical activity of single muscle fibers. J. Cell. Comp. Physiol. 1950, 35, 39–73.
28. Pool J. G., Shannon A. E. Production of high-potency concentrates of antihemophilic globulin in a closed-bag system. N. Engl. J. Med. 1965, 273, 1443–1447.
29. Hodgkin A. L., Horowicz P. The influence of potassium and chloride ions on the membrane potential of single muscle fibres. J. Physiol. 1959, 148, 127–160.
30. Goldman D. E. Potential, impedance, and rectification in membranes. J. Gen. Physiol. 1943, 27, 37–60.
31. Hodgkin A. L., Katz B. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid. J. Physiol. 1949, 108, 37–77.
32. Bretag A. H. Muscle chloride channels. Physiol. Rev. 1987, 67, 618–724.
33. Beck C. L., Fahlke C., George A. L. Molecular basis for decreased muscle chloride conductance in the myotonic goat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 11248–11252.
34. Adrian R. H., Bryant S. H. On the repetitive discharge in myotonic muscle fibres. J. Physiol. 1974, 240, 505–515.
35. Ketchum K. A., Joiner W. J., Sellers A. J. et al. A new family of outwardly rectifying potassium channel proteins with two pore domains in tandem. Nature 1995, 376, 690–695.
36. Lesage F., Guillemare E., Fink M. et al. TWIK-1, a ubiquitous human weakly inward rectifying K⁺ channel with a novel structure. EMBO J. 1996, 15, 1004–1011.
37. Enyedi P., Czirják G. Molecular background of leak K⁺ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 2010, 90, 559–605.
38. Lu B., Su Y., Das S. et al. The neuronal channel NALCN contributes resting sodium permeability and is required for normal respiratory rhythm. Cell 2007, 129, 371–383.
39. MacKinnon R. Potassium channels and the atomic basis of selective ion conduction (Nobel lecture). Biosci. Rep. 2004, 24, 75–100.
40. Doyle D. A., Morais Cabral J., Pfuetzner R. A. et al. The structure of the potassium channel: molecular basis of K⁺ conduction and selectivity. Science 1998, 280, 69–77.
41. Marcus Y. Thermodynamics of solvation of ions. Part 5. Gibbs free energy of hydration at 298.15 K. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1991, 87, 2995–2999.
42. Zhou Y., Morais-Cabral J. H., Kaufman A., MacKinnon R. Chemistry of ion coordination and hydration revealed by a K⁺ channel–Fab complex at 2.0 Å resolution. Nature 2001, 414, 43–48.
43. Noskov S. Y., Bernèche S., Roux B. Control of ion selectivity in potassium channels by electrostatic and dynamic properties of carbonyl ligands. Nature 2004, 431, 830–834.
44. Köpfer D. A., Song C., Gruene T. et al. Ion permeation in K⁺ channels occurs by direct Coulomb knock-on. Science 2014, 346, 352–355.
45. Glynn I. M. A hundred years of sodium pumping. Annu. Rev. Physiol. 2002, 64, 1–18.
46. Hodgkin A. L., Keynes R. D. Active transport of cations in giant axons from Sepia and Loligo. J. Physiol. 1955, 128, 28–60.
47. Caldwell P. C., Hodgkin A. L., Keynes R. D., Shaw T. I. The effects of injecting “energy-rich” phosphate compounds on the active transport of ions in the giant axons of Loligo. J. Physiol. 1960, 152, 561–590.
48. Skou J. C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta 1957, 23, 394–401.
49. Post R. L., Jolly P. C. The linkage of sodium, potassium, and ammonium active transport across the human erythrocyte membrane. Biochim. Biophys. Acta 1957, 25, 118–128.
50. Gadsby D. C. Ion channels versus ion pumps: the principal difference, in principle. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 344–352.
51. Morth J. P., Pedersen B. P., Toustrup-Jensen M. S. et al. Crystal structure of the sodium–potassium pump. Nature 2007, 450, 1043–1049.
52. Shinoda T., Ogawa H., Cornelius F., Toyoshima C. Crystal structure of the sodium–potassium pump at 2.4 Å resolution. Nature 2009, 459, 446–450.
53. Kanai R., Ogawa H., Vilsen B., Cornelius F., Toyoshima C. Crystal structure of a Na⁺-bound Na⁺,K⁺-ATPase preceding the E1P state. Nature 2013, 502, 201–206.
54. Thomas R. C. Electrogenic sodium pump in nerve and muscle cells. Physiol. Rev. 1972, 52, 563–594.
55. Mullins L. J., Noda K. The influence of sodium-free solutions on the membrane potential of frog muscle fibers. J. Gen. Physiol. 1963, 47, 117–132.
56. Rolfe D. F. S., Brown G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol. Rev. 1997, 77, 731–758.
57. Raichle M. E., Gusnard D. A. Appraising the brain’s energy budget. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 10237–10239.
58. Attwell D., Laughlin S. B. An energy budget for signaling in the grey matter of the brain. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2001, 21, 1133–1145.
59. Donnan F. G. Theorie der Membrangleichgewichte und Membranpotentiale bei Vorhandensein von nicht dialysierenden Elektrolyten. Z. Elektrochem. 1911, 17, 572–581.
60. Tosteson D. C., Hoffman J. F. Regulation of cell volume by active cation transport in high and low potassium sheep red cells. J. Gen. Physiol. 1960, 44, 169–194.
61. Dreier J. P., Major S., Foreman B. et al. Terminal spreading depolarization and electrical silence in death of human cerebral cortex. Ann. Neurol. 2018, 83, 295–310.
62. Baker P. F., Hodgkin A. L., Shaw T. I. Replacement of the axoplasm of giant nerve fibres with artificial solutions. J. Physiol. 1962, 164, 330–354.
63. Baker P. F., Hodgkin A. L., Shaw T. I. The effects of changes in internal ionic concentrations on the electrical properties of perfused giant axons. J. Physiol. 1962, 164, 355–374.
64. Schatzmann H. J. Herzglykoside als Hemmstoffe für den aktiven Kalium- und Natriumtransport durch die Erythrocytenmembran. Helv. Physiol. Pharmacol. Acta 1953, 11, 346–354.
65. Kingdon J., Agwanda B., Kinnaird M. et al. A poisonous surprise under the coat of the African crested rat. Proc. R. Soc. B 2012, 279, 675–680.
66. Dobler S., Dalla S., Wagschal V., Agrawal A. A. Community-wide convergent evolution in insect adaptation to toxic cardenolides by substitutions in the Na,K-ATPase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, 13040–13045.
67. Karageorgi M., Groen S. C., Sumbul F. et al. Genome editing retraces the evolution of toxin resistance in the monarch butterfly. Nature 2019, 574, 409–412.
68. Moore R. E., Scheuer P. J. Palytoxin: a new marine toxin from a coelenterate. Science 1971, 172, 495–498.
69. Artigas P., Gadsby D. C. Na⁺/K⁺-pump ligands modulate gating of palytoxin-induced ion channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 501–505.
70. Kuffler S. W., Nicholls J. G., Orkand R. K. Physiological properties of glial cells in the central nervous system of amphibia. J. Neurophysiol. 1966, 29, 768–787.
71. Kofuji P., Newman E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience 2004, 129, 1043–1054.
72. Hoffman J. F., Laris P. C. Determination of membrane potentials in human and Amphiuma red blood cells by means of a fluorescent probe. J. Physiol. 1974, 239, 519–552.
73. Pedersen B. P., Buch-Pedersen M. J., Morth J. P., Palmgren M. G., Nissen P. Crystal structure of the plasma membrane proton pump. Nature 2007, 450, 1111–1114.
74. Palmgren M. G. Plant plasma membrane H⁺-ATPases: powerhouses for nutrient uptake. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001, 52, 817–845.
75. Slayman C. L. Electrical properties of Neurospora crassa. Respiration and the intracellular potential. J. Gen. Physiol. 1965, 49, 93–116.
76. Felle H., Porter J. S., Slayman C. L., Kaback H. R. Quantitative measurements of membrane potential in Escherichia coli. Biochemistry 1980, 19, 3585–3590.
77. Kralj J. M., Hochbaum D. R., Douglass A. D., Cohen A. E. Electrical spiking in Escherichia coli probed with a fluorescent voltage-indicating protein. Science 2011, 333, 345–348.
78. Prindle A., Liu J., Asally M. et al. Ion channels enable electrical communication in bacterial communities. Nature 2015, 527, 59–63.
79. Zorova L. D., Popkov V. A., Plotnikov E. Y. et al. Mitochondrial membrane potential. Anal. Biochem. 2018, 552, 50–59.
80. Wright E. M., Loo D. D. F., Hirayama B. A. Biology of human sodium glucose transporters. Physiol. Rev. 2011, 91, 733–794.
81. Water with sugar and salt (editorial). Lancet 1978, 312, 300–301.
82. Ashcroft F. M., Harrison D. E., Ashcroft S. J. H. Glucose induces closure of single potassium channels in isolated rat pancreatic β-cells. Nature 1984, 312, 446–448.
83. Gloyn A. L., Pearson E. R., Antcliff J. F. et al. Activating mutations in the gene encoding the ATP-sensitive potassium-channel subunit Kir6.2 and permanent neonatal diabetes. N. Engl. J. Med. 2004, 350, 1838–1849.
84. Pearson E. R., Flechtner I., Njølstad P. R. et al. Switching from insulin to oral sulfonylureas in patients with diabetes due to Kir6.2 mutations. N. Engl. J. Med. 2006, 355, 467–477.
85. Jaffe L. A. Fast block to polyspermy in sea urchin eggs is electrically mediated. Nature 1976, 261, 68–71.
86. Yang M., Brackenbury W. J. Membrane potential and cancer progression. Front. Physiol. 2013, 4, 185.
87. Zhou Y., Wong C.-O., Cho K. et al. Membrane potential modulates plasma membrane phospholipid dynamics and K-Ras signaling. Science 2015, 349, 873–876.
88. Patel A. J., Honoré E., Lesage F. et al. Inhalational anesthetics activate two-pore-domain background K⁺ channels. Nat. Neurosci. 1999, 2, 422–426.
89. Ding F., O’Donnell J., Xu Q. et al. Changes in the composition of brain interstitial ions control the sleep-wake cycle. Science 2016, 352, 550–555.
90. Hibino H., Kurachi Y. Molecular and physiological bases of the K⁺ circulation in the mammalian inner ear. Physiology 2006, 21, 336–345.
91. Weiss J. N., Qu Z., Shivkumar K. Electrophysiology of hypokalemia and hyperkalemia. Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 2017, 10, e004667.
92. Melrose D. G., Dreyer B., Bentall H. H., Baker J. B. E. Elective cardiac arrest. Lancet 1955, 266, 21–23.
93. Jurkat-Rott K., Weber M.-A., Fauler M. et al. K⁺-dependent paradoxical membrane depolarization and Na⁺ overload, major and reversible contributors to weakness by ion channel leaks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009, 106, 4036–4041.
94. Neher E., Sakmann B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature 1976, 260, 799–802.
95. Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Arch. 1981, 391, 85–100.
96. Lazzari-Dean J. R., Gest A. M. M., Miller E. W. Optical estimation of absolute membrane potential using fluorescence lifetime imaging. eLife 2019, 8, e44522.