В 1966 году микробиолог Томас Брок взял пробы из горячего источника в Йеллоустонском национальном парке (США) и выделил бактерию, живущую при 70 °C. Её назвали Thermus aquaticus. Через двадцать лет фермент этой бактерии — ДНК-полимераза, выдерживающая кипячение, — сделал возможной полимеразную цепную реакцию, без которой сейчас не обходятся ни медицина, ни криминалистика, ни биологическая наука. История этой бактерии — пример того, как фундаментальное исследование «бесполезных» микробов приводит к технологии, меняющей мир. В статье разобраны жизнь термофилов, устройство их белков, свойства Taq-полимеразы и судьба открытия.
- 1. Экстремофилы
- 2. Открытие Thermus aquaticus
- 3. Почему белки термофилов не денатурируют
- 4. Taq-полимераза и ПЦР
- 5. Свойства Taq-полимеразы
- 6. Другие ферменты экстремофилов
- 7. Кому принадлежат открытия
- 8. Для олимпиад
- Задания с разбором
1. Экстремофилы
Экстремофилы — организмы, живущие в условиях, губительных для большинства живых существ. Большинство из них — прокариоты (бактерии и археи).
| Группа | Условия | Примеры |
|---|---|---|
| Термофилы | Оптимум 45–80 °C | Thermus aquaticus (около 70 °C) |
| Гипертермофилы | Оптимум выше 80 °C | Археи Pyrococcus furiosus (около 100 °C); рекорд — штамм Methanopyrus kandleri, растущий при 122 °C под давлением |
| Психрофилы | Оптимум ниже 15 °C | Бактерии полярных льдов и глубин океана |
| Ацидофилы | pH ниже 3 | Археи Picrophilus (около pH 0,7) |
| Алкалофилы | pH выше 9 | Бактерии содовых озёр |
| Галофилы | Высокая концентрация соли | Галоархеи солёных озёр (окрашивают их в розовый цвет) |
| Пьезофилы | Высокое давление | Обитатели глубоководных впадин |
Горячие источники изучают и российские микробиологи: в кальдере Узон на Камчатке сотрудники Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН описали множество новых термофильных бактерий и архей.
2. Открытие Thermus aquaticus
В 1960-е годы считалось, что выше 55 °C жизнь почти невозможна. Томас Брок из Индианского университета заметил в стоках горячих источников Йеллоустона розовые нити бактерий при температурах, близких к кипению. Вместе со студентом Хадсоном Фризом в 1966 году он выделил из источника Грибного (Mushroom Spring) палочковидную бактерию, растущую при 50–80 °C с оптимумом около 70 °C. В 1969 году её описали как Thermus aquaticus («тепловой водный»). Брок передал культуру в Американскую коллекцию типовых культур, откуда её мог получить любой исследователь.
Брок изучал не ферменты, а экологию: как устроены сообщества микроорганизмов в горячих источниках, как они меняются с температурой. Практического применения его работа не имела — до тех пор, пока не понадобился фермент, выдерживающий кипячение.
3. Почему белки термофилов не денатурируют
При нагревании белок теряет пространственную структуру — денатурирует: тепловое движение разрывает слабые связи (водородные, ионные, гидрофобные взаимодействия), удерживающие форму молекулы. Первичная структура (последовательность аминокислот) при этом сохраняется, но функция теряется.
Белки термофилов построены из тех же 20 аминокислот, но отличаются:
- большим числом ионных связей (солевых мостиков) между положительно и отрицательно заряженными аминокислотами на поверхности;
- более плотной упаковкой гидрофобного ядра, без пустот;
- укороченными петлями на поверхности, которые легче всего «разворачиваются»;
- большей долей аминокислот, придающих жёсткость цепи (например, пролина в петлях).
Каждое отличие даёт немного, но вместе они поднимают температуру денатурации на десятки градусов. Устойчивы и другие компоненты клетки: у гипертермофильных архей мембраны состоят из липидов с простыми эфирными связями, а некоторые образуют однослойную мембрану из молекул, пронизывающих её насквозь.
4. Taq-полимераза и ПЦР
В 1976 году группа Джона Трелы выделила из Thermus aquaticus ДНК-полимеразу, которая работала при 80 °C. Тогда эта находка интересовала лишь узкий круг специалистов.
В 1983 году химик Кэри Муллис из калифорнийской биотехнологической компании «Цетус» придумал полимеразную цепную реакцию (подробно о ней — в статье «ПЦР»). В первых опытах использовали полимеразу кишечной палочки. Она разрушалась при каждом нагревании до 95 °C, и после каждого цикла фермент приходилось добавлять заново, вручную, открывая пробирку. Это было долго, дорого и приводило к ошибкам и загрязнениям.
В 1988 году сотрудники «Цетуса» (Рэндалл Сайки и соавторы) заменили полимеразу кишечной палочки на Taq-полимеразу. Результаты:
- фермент добавляли один раз в начале реакции, и её можно было проводить в автоматическом приборе;
- отжиг праймеров и синтез стало возможно вести при высокой температуре, и праймеры перестали связываться с похожими, но неточными участками — специфичность резко выросла;
- удалось размножать более длинные фрагменты ДНК.
В 1989 году журнал Science назвал Taq-полимеразу «молекулой года». Муллис получил Нобелевскую премию по химии 1993 года.
5. Свойства Taq-полимеразы
| Свойство | Значение | Следствие |
|---|---|---|
| Оптимальная температура | 72–80 °C | Этап синтеза в ПЦР проводят при 72 °C |
| Устойчивость | Сохраняет половину активности после 40 минут при 95 °C | Выдерживает 30–40 циклов |
| Скорость | Около 1000 нуклеотидов в минуту | Время синтеза рассчитывают по длине продукта |
| Корректирующая 3′→5′-экзонуклеазная активность | Нет | Ошибки примерно раз на 104–105 нуклеотидов |
| 5′→3′-экзонуклеазная активность | Есть | Разрушает встреченную на пути цепь; на этом основан метод зондов в ПЦР в реальном времени |
| Добавление нуклеотида А на 3′-конце | Есть | Продукты ПЦР имеют выступающий А; на этом основан простой способ их встраивания в векторы |
Сейчас Taq-полимеразу получают не из самой бактерии, а из кишечной палочки, в которую встроен её ген. Для точных задач используют полимеразы гипертермофильных архей (например, Pfu из Pyrococcus furiosus), которые исправляют свои ошибки, или искусственно улучшенные ферменты.
6. Другие ферменты экстремофилов
- Ферменты для моющих средств — протеазы и липазы алкалофилов работают в щелочном растворе стирального порошка.
- Ферменты психрофилов активны в холодной воде и позволяют стирать при низкой температуре, экономя энергию.
- Термостабильные амилазы используют для расщепления крахмала при высокой температуре в пищевой промышленности.
- Бактериородопсин галоархей — светочувствительный белок, изучаемый как прототип оптических устройств.
Экстремофилы интересны и астробиологам: они показывают границы условий, в которых возможна жизнь, и подсказывают, где её искать на других планетах.
7. Кому принадлежат открытия
Компания «Цетус» запатентовала ПЦР и применение Taq-полимеразы и в 1991 году продала права фармацевтической компании «Хоффманн-Ля Рош» за 300 млн долларов. Томас Брок, выделивший бактерию, и Йеллоустонский парк, где её нашли, ничего не получили. История вызвала споры о том, кому должна принадлежать выгода от использования природных организмов. В 2010 году был принят международный Нагойский протокол, по которому выгоды от использования генетических ресурсов должны справедливо распределяться со страной их происхождения.
Повторить строение белков и денатурацию можно в уроках по биохимии клетки и в тренажёре по теме 2.2, а методы молекулярной биологии — в уроке «Методы клеточной биологии».
Частые ошибки. 1) «Термофилы живут в кипятке, потому что их белки не имеют пространственной структуры» — структура есть, она лишь устойчивее за счёт дополнительных связей. 2) «При денатурации разрушается первичная структура белка» — разрушаются вторичная, третичная и четвертичная; первичная сохраняется. 3) «Taq-полимераза исправляет свои ошибки» — нет, у неё нет корректирующей активности.
8. Для олимпиад
Почему верхний предел жизни около 120 °C
При температуре выше 120–130 °C быстро разрушаются не только белки, но и небольшие молекулы, без которых невозможен обмен веществ: АТФ гидролизуется за минуты, НАД разрушается, нуклеиновые кислоты теряют основания. Клетка тратила бы больше энергии на восстановление молекул, чем может получить. Поэтому предел жизни определяется не только белками, но и химической устойчивостью малых молекул. Вода под высоким давлением остаётся жидкой и при этих температурах, поэтому гипертермофилы живут в глубоководных гидротермальных источниках.
Обратная гираза
У всех гипертермофилов есть фермент обратная гираза, которого нет у организмов, живущих при умеренных температурах. Он закручивает ДНК так, что двойная спираль становится «плотнее» и труднее расплетается при нагревании. Это пример приспособления, направленного не на белки, а на ДНК.
Задания с разбором
Сначала ответьте сами, затем откройте разбор.
Задание 1
Какие особенности строения белков термофилов делают их устойчивыми к нагреванию?
Разбор
1) Больше ионных связей (солевых мостиков) на поверхности. 2) Плотнее упакованное гидрофобное ядро без пустот. 3) Короткие поверхностные петли. 4) Больше аминокислот, придающих жёсткость цепи. Вместе они удерживают третичную структуру при высокой температуре.
Задание 2
Почему до использования Taq-полимеразы ПЦР была трудоёмкой и неточной?
Разбор
1) Полимераза кишечной палочки денатурировала при каждом нагревании до 95 °C, и её добавляли после каждого цикла вручную. 2) Каждое открывание пробирки увеличивало риск загрязнения. 3) Отжиг и синтез вели при 37 °C, и праймеры связывались с неточно комплементарными участками — образовывались лишние продукты.
Задание 3
Почему высокая температура отжига и синтеза повышает специфичность ПЦР?
Разбор
1) Праймер, связанный с неточно комплементарным участком, удерживается меньшим числом водородных связей. 2) При высокой температуре такие непрочные комплексы распадаются, а полностью комплементарные остаются. 3) Поэтому полимераза достраивает только правильно связанные праймеры.
Задание 4 (олимпиадное)
Почему жизнь не может существовать при 150 °C, даже если найти белки, выдерживающие такую температуру?
Разбор
1) При таких температурах быстро разрушаются малые молекулы обмена веществ: АТФ гидролизуется, коферменты (НАД) распадаются, нуклеиновые кислоты теряют азотистые основания. 2) Клетке пришлось бы постоянно синтезировать их заново, расходуя больше энергии, чем она получает. 3) Липидные мембраны становятся слишком проницаемыми для ионов и протонов, и клетка не может поддерживать градиенты для синтеза АТФ.
Задание 5 (олимпиадное)
Продукты ПЦР с Taq-полимеразой легко встраиваются в вектор, на концах которого выступает один нуклеотид Т, а продукты ПЦР с полимеразой Pfu — нет. Объясните.
Разбор
1) Taq-полимераза добавляет к 3′-концу синтезированной цепи один лишний нуклеотид А, не связанный с матрицей. 2) Выступающий А комплементарен выступающему Т вектора, и концы соединяются ДНК-лигазой. 3) Pfu обладает корректирующей 3′→5′-экзонуклеазной активностью, удаляет лишние нуклеотиды и даёт ровные (тупые) концы, которые не спариваются с выступающим Т.
Литература
- Brock T. D., Freeze H. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile // Journal of Bacteriology. 1969. Vol. 98. P. 289–297.
- Chien A., Edgar D. B., Trela J. M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus // Journal of Bacteriology. 1976. Vol. 127. P. 1550–1557.
- Saiki R. K. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. Vol. 239. P. 487–491.
- Takai K. et al. Cell proliferation at 122 °C and isotopically heavy CH4 production by a hyperthermophilic methanogen under high-pressure cultivation // PNAS. 2008. Vol. 105. P. 10949–10954.
Обсуждение
Загружаем обсуждение…