Микробиологический синтез: белок, аминокислоты и витамины из микроорганизмов

Глутамат натрия в приправах, лизин в кормах для свиней и кур, витамин B₁₂ в таблетках, лимонная кислота в газировке, кормовой белок для рыбных ферм — всё это производят не химические заводы, а микроорганизмы в огромных стальных баках. Такое производство называют микробиологическим синтезом. Он отличается от традиционной биотехнологии: здесь нужен не хлеб или сыр, а чистое вещество, и микроорганизм для этого специально отбирают и изменяют так, чтобы он производил вещества во много раз больше, чем нужно ему самому.

В этой статье разобрано, что такое микробиологический синтез и какие микроорганизмы в нём работают, как устроено производство от пробирки до готового продукта, как получают кормовой и пищевой белок, аминокислоты и витамины, почему для этого нужны мутантные штаммы и чем микробиологический синтез лучше химического. В кодификаторе ЕГЭ по биологии 2027 года тема входит в элемент 3.7: «Микробиологический синтез. Объекты микробиологических технологий. Производство белка, аминокислот и витаминов». Об объектах биотехнологии в целом — статья «Объекты биотехнологии», о хлебе, кефире и вине — «Традиционная биотехнология». В конце — что писать на ЕГЭ, раздел для олимпиад и 13 заданий с разбором.

• Что такое микробиологический синтез
• Объекты микробиологических технологий
• Как устроено производство
• Как получают штаммы-продуценты
• Производство белка
• Производство аминокислот
• Производство витаминов
• Что ещё производят микроорганизмы
• Чем микробиологический синтез лучше химического
• История
• Удивительные факты
• Что писать на ЕГЭ
• Для олимпиад
• Задания с разбором

Что такое микробиологический синтез

Продукты микробиологического синтеза делят на три группы.

1. Биомасса — сами клетки: кормовые дрожжи, бактериальный белок, микопротеин, спирулина.
2. Первичные метаболиты — вещества, нужные клетке для роста: аминокислоты, нуклеотиды, витамины, органические кислоты, спирты. Клетка обычно производит их ровно столько, сколько нужно ей самой, поэтому для промышленности регуляцию приходится «ломать».
3. Вторичные метаболиты — вещества, без которых клетка может расти, но которые выгодны ей в природе: антибиотики, пигменты, токсины. Их образуют в основном в конце роста культуры.

Отдельная группа — продукты чужих генов, введённых в микроорганизм методами генной инженерии: инсулин, гормон роста, белки вакцин, химозин для сыроделия. Как получают такие штаммы — в статье «Искусственный синтез гена и конструирование рекомбинантных ДНК».

Объекты микробиологических технологий

Для микробиологического синтеза используют бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы и микроводоросли. Их выбирают за быстрый рост на дешёвых средах, высокий выход продукта, безопасность и удобство генетической работы (подробнее — в статье «Объекты биотехнологии»).

Как устроено производство

Сердце производства — ферментёр: стальной бак объёмом от нескольких до сотен кубических метров с мешалкой, подачей стерильного воздуха, рубашкой для охлаждения и датчиками. Микроорганизмы при росте выделяют много тепла, поэтому ферментёр нужно не греть, а охлаждать. Главное требование — стерильность: если в ферментёр попадёт посторонний микроорганизм, растущий быстрее продуцента, вся партия будет потеряна.

Выращивают тремя способами (Stanbury и соавторы, 2017):

• периодически — ферментёр заполняют, засевают и после окончания процесса сливают целиком;
• с подпиткой — питательные вещества добавляют понемногу по ходу роста; так получают большинство аминокислот, антибиотиков и белков;
• непрерывно — свежая среда поступает постоянно, и столько же культуры отводится; так работали установки кормового белка.

Сырьё — дешёвые отходы и продукты сельского хозяйства: патока (меласса) — отход сахарного производства, глюкоза из кукурузного или пшеничного крахмала, кукурузный экстракт, а для кормового белка — метанол, природный газ, отходы целлюлозной промышленности.

Как получают штаммы-продуценты

Природный микроорганизм производит вещества экономно: ровно столько, сколько нужно ему самому. Его обмен веществ регулируется по принципу обратной связи: когда конечного продукта становится много, он тормозит первый фермент своего пути. Промышленный же штамм должен выделять продукт в среду в огромных количествах. Поэтому штаммы улучшают.

1. Отбор природных штаммов. Японские исследователи в 1956–1957 годах проверили сотни почвенных бактерий и нашли ту, что выделяет глутамат, — Corynebacterium glutamicum (Kinoshita и соавторы, 1957).
2. Мутагенез и отбор. Клетки обрабатывают ультрафиолетом или химическими мутагенами и отбирают редких мутантов с нужными свойствами. Так из исходного штамма пеницилла вывели штаммы, дающие пенициллина во много раз больше.
3. Генная и метаболическая инженерия. После того как в 2003 году прочли геном коринебактерии (Kalinowski и соавторы, 2003), в штаммы стали направленно вносить изменения: усиливать нужные ферменты, выключать побочные пути, снимать торможение обратной связью (Wendisch, 2020).

Производство белка

Белок, полученный из микроорганизмов, называют белком одноклеточных (по-английски single-cell protein). Микроорганизмы содержат много белка: бактерии — 50–80 % сухой массы, дрожжи — 40–55 %, мицелиальные грибы — 30–45 %, водоросли — 40–60 %. И растут они несравнимо быстрее животных: масса дрожжей в ферментёре удваивается за несколько часов, а бычок прибавляет в день лишь около 0,2 % своей массы (Litchfield, 1983).

• Кормовые дрожжи выращивают на патоке, отходах спиртового производства, гидролизатах древесины; их добавляют в корма скота и птицы.
• Бактериальный белок. В 1980 году в Великобритании заработал завод «Прутин» компании ICI: бактерия Methylophilus methylotrophus росла на метаноле в одном из крупнейших ферментёров мира. Продукт оказался дороже соевой муки, и производство закрыли. Сейчас кормовой белок для рыбных ферм получают из бактерии Methylococcus capsulatus, растущей на природном газе (Ritala и соавторы, 2017).
• Микопротеин — биомасса мицелиального гриба Fusarium venenatum. С 1985 года он продаётся как пищевой мясозаменитель (Wiebe, 2002).
• Спирулина и хлорелла — сушёная биомасса используется как пищевая добавка.

Производство аминокислот

Аминокислоты производят миллионами тонн: глутамата — около 3 млн т в год, лизина — больше 2 млн т (Wendisch, 2020). Почти всё это — работа одной бактерии, Corynebacterium glutamicum, а также кишечной палочки.

• Глутамат натрия — усилитель вкуса. Коринебактерия выделяет глутамат, если ей не хватает витамина биотина или если в среду добавить небольшое количество пенициллина: оба воздействия нарушают строение клеточной оболочки, и глутамат выходит наружу.
• Лизин — главная кормовая аминокислота. Он незаменим для животных и человека, а в зерне кукурузы, пшеницы и ячменя его мало. Добавка лизина к зерновым кормам повышает усвоение всего белка корма: животное растёт быстрее на меньшем количестве корма.
• Треонин, триптофан, метионин тоже добавляют в корма; треонин и триптофан получают с помощью кишечной палочки, метионин — в основном химически.

Почему дикая коринебактерия не выделяет лизин? Первый фермент пути, аспартаткиназа, тормозится лизином и треонином, если оба накапливаются одновременно. В 1961 году получили мутанта, не способного синтезировать гомосерин (Nakayama и соавторы, 1961). Ему дают немного треонина и метионина для роста, но мало, чтобы торможение не срабатывало, и весь поток вещества уходит в лизин. Позже отобрали мутантов, у которых аспартаткиназа не чувствительна к лизину вовсе. Такие мутанты отбирают на среде с ядовитым аналогом лизина: выживают те, у кого фермент не «видит» лизин.

Производство витаминов

• Витамин B₁₂ (кобаламин) синтезируют только бактерии и археи: ни растения, ни животные этого не умеют. Его синтез включает около 30 ферментативных реакций (Martens и соавторы, 2002). Химический синтез витамина B₁₂, завершённый Р. Вудвордом и А. Эшенмозером в 1972 году, потребовал около ста стадий и для промышленности непригоден (Woodward, 1973). Поэтому весь витамин B₁₂ получают микробиологически — с помощью Pseudomonas denitrificans и пропионовокислых бактерий.
• Витамин B₂ (рибофлавин) раньше получали химически, а сейчас — только с помощью гриба Ashbya gossypii и сенной палочки (Schwechheimer и соавторы, 2016). Переход на микробиологический способ сократил отходы и стоимость.
• Витамин C получают химико-микробиологическим путём: один или два этапа окисления выполняют уксуснокислые бактерии Gluconobacter, остальные — химики.
• β-Каротин (провитамин A) — с помощью гриба Blakeslea trispora и водоросли Dunaliella.
• Витамин D₂ образуется из эргостерина дрожжей при облучении ультрафиолетом.

Что ещё производят микроорганизмы

Чем микробиологический синтез лучше химического

1. Мягкие условия: температура около 30 °C, нормальное давление, вода как растворитель — в отличие от высоких температур, давлений и ядовитых растворителей химического синтеза.
2. Нужный оптический изомер. Ферменты синтезируют только L-аминокислоты, а химический синтез даёт смесь L- и D-форм пополам, которую приходится разделять. Животные усваивают только L-аминокислоты.
3. Возобновляемое сырьё: сахар, крахмал, отходы вместо нефти.
4. Сложные молекулы, которые химически получить невозможно или слишком дорого (витамин B₁₂, антибиотики, белки).
5. Меньше отходов, хотя остаются сточные воды и биомасса, которую нужно перерабатывать.

Недостатки — необходимость строгой стерильности, сложное и дорогое выделение продукта из разбавленного раствора, зависимость от стоимости сахара. Поэтому некоторые вещества, например метионин, по-прежнему выгоднее получать химически.

История

Промышленный микробиологический синтез начался в 1917–1923 годах, когда американский химик Джеймс Карри предложил получать лимонную кислоту с помощью аспергилла (Currie, 1917) и производство перенесли из Италии, где её выделяли из лимонов, на заводы. Настоящий толчок дал пенициллин: во время Второй мировой войны научились выращивать пеницилл в больших баках с перемешиванием и аэрацией, и эта техника стала основой всей отрасли. В 1950-х годах японские исследователи открыли бактерию, выделяющую глутамат, и создали производство аминокислот. В 1970–1980-х годах появились установки кормового белка и генно-инженерные штаммы, производящие белки человека.

Удивительные факты

• Бактерия-миллионер. Одна-единственная бактерия, Corynebacterium glutamicum, ежегодно производит миллионы тонн аминокислот — больше, чем любой другой организм, используемый человеком в промышленности.
• Витамин, который не делает ни одно растение. Витамин B₁₂ в пищу человека попадает только из животных продуктов (животные получают его от бактерий кишечника и корма) или из таблеток, сделанных бактериями. Поэтому строгим вегетарианцам нужны добавки.
• Белок из газа. Бактерия Methylococcus capsulatus растёт на метане, кислороде и аммиаке — без сахара и без света — и даёт корм, богатый белком.
• Ферментёр высотой с дом. Ферментёр завода «Прутин» объёмом около 1500 м³ был одним из крупнейших в мире: воздух не перемешивали мешалкой, а прокачивали снизу вверх, и он сам заставлял жидкость циркулировать.

Что писать на ЕГЭ

Опорные формулировки:

• Микробиологический синтез — промышленное получение веществ с помощью микроорганизмов.
• Объекты: бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы, микроводоросли; их достоинства — быстрое размножение, высокая интенсивность обмена, дешёвые питательные среды, возможность генетического улучшения.
• Производство белка (кормовые дрожжи, бактериальный белок, микопротеин), аминокислот (лизин, глутамат), витаминов (B₁₂, B₂, C, β-каротин), органических кислот, ферментов, антибиотиков, гормонов.
• Высокопродуктивные штаммы получают мутагенезом с отбором и методами генной инженерии.
• Преимущества: мягкие условия, получение L-аминокислот, возобновляемое сырьё, синтез сложных молекул.

Для тренировки — тема 3.7 в тренажёре ЕГЭ по биологии.

Для олимпиад

Выход продукта

Выход продукта Y_P/S — масса продукта на единицу массы израсходованного сахара. Теоретический максимум определяется стехиометрией: при синтезе глутамата из глюкозы C₆H₁₂O₆ + NH₃ + 1,5O₂ → C₅H₉NO₄ + CO₂ + 3H₂O из 1 моль глюкозы получается 1 моль глутамата, то есть 147 / 180 ≈ 0,82 г на грамм. На практике часть сахара уходит на рост и дыхание, и выход составляет около 0,5–0,6 г/г.

Производительность

Объёмная производительность — масса продукта в единице объёма за единицу времени. Для непрерывного процесса она равна D · X, где D — скорость разбавления (доля объёма, заменяемая за час), X — концентрация продукта или биомассы. Именно непрерывные процессы давали рекордную производительность по кормовому белку, но они чувствительнее к заражению и к появлению в культуре мутантов-«нахлебников».

Обратная связь и мутанты-продуценты

Классическая стратегия получения продуцента первичного метаболита — снять регуляцию: 1) ауксотрофный мутант по ветви, конкурирующей за общий предшественник (без гомосерина — больше лизина); 2) мутант, устойчивый к ядовитому аналогу продукта: аналог, как и продукт, тормозит фермент, и выживают только клетки с ферментом, нечувствительным к торможению; 3) усиление выхода продукта из клетки (белки-экспортёры). Современная метаболическая инженерия сочетает все три подхода и добавляет к ним перенаправление углерода в нужный путь.

Задания с разбором

Задания 1–9 — в формате ЕГЭ (с элементами ответа для заданий с развёрнутым ответом), 10–13 — олимпиадные.

Задание 1

Выберите три вещества, которые получают микробиологическим синтезом.

1. лизин
2. витамин B₁₂
3. кормовой белок дрожжей
4. поваренная соль
5. полиэтилен
6. серная кислота

Задание 2

Установите соответствие между продуктами и микроорганизмами, которые их производят.

ПРОДУКТЫ: А) глутамат; Б) витамин B₁₂; В) рибофлавин; Г) микопротеин; Д) лимонная кислота; Е) пенициллин.

МИКРООРГАНИЗМЫ: 1) Corynebacterium glutamicum; 2) пропионовокислые бактерии; 3) Ashbya gossypii; 4) Fusarium venenatum; 5) Aspergillus niger; 6) Penicillium chrysogenum.

Задание 3

Установите последовательность этапов микробиологического производства.

1. выделение и очистка продукта
2. приготовление и стерилизация питательной среды
3. выращивание продуцента в ферментёре
4. отделение биомассы от жидкости
5. наращивание посевного материала из банка клеток

Задание 4

Почему лизин, полученный микробиологическим синтезом, добавляют в корма для свиней и птицы?

Задание 5

Почему для производства аминокислот используют мутантные, а не природные штаммы бактерий?

Задание 6

Белок бактерий содержит все незаменимые аминокислоты, но его не используют напрямую как основную пищу человека. Почему? Как решают эту проблему?

Задание 7

Найдите три ошибки в приведённом тексте. Укажите номера предложений, в которых сделаны ошибки, исправьте их.

(1) Микробиологический синтез — получение веществ с помощью микроорганизмов. (2) Витамин B₁₂ синтезируют растения, а микроорганизмы его не образуют. (3) Глутамат производят с помощью бактерии Corynebacterium glutamicum. (4) Лизин — заменимая аминокислота, поэтому его не добавляют в корма. (5) Высокопродуктивные штаммы получают мутагенезом с последующим отбором. (6) При химическом синтезе аминокислот образуются только L-изомеры.

Задание 8

Почему витамин B₁₂ получают только микробиологическим синтезом?

Задание 9

Назовите не менее трёх преимуществ микробиологического синтеза аминокислот перед химическим.

Задание 10 (олимпиадное)

Завод перерабатывает 100 т глюкозы в глутамат с выходом 0,6 г глутаминовой кислоты на грамм глюкозы. 1) Какую долю это составляет от теоретического выхода (1 моль глутаминовой кислоты, M = 147 г/моль, на 1 моль глюкозы, M = 180 г/моль)? 2) Сколько тонн глутамата натрия моногидрата C₅H₈NO₄Na · H₂O (M = 187 г/моль) получится?

Задание 11 (олимпиадное)

В ферментёр засеяли 100 кг кормовых дрожжей. Масса дрожжей удваивается каждые 3 часа, рост идёт без ограничений сутки. Белок составляет половину сухой массы, а сухая масса — 20 % сырой. 1) Сколько сырой биомассы получится через сутки? 2) Сколько это белка? 3) Сравните с бычком массой 500 кг, прибавляющим 1 кг в сутки (белок — около 20 % прибавки).

Задание 12 (олимпиадное)

Непрерывный ферментёр объёмом 100 м³ работает при скорости разбавления 0,2 ч⁻¹, концентрация биомассы в вытекающей культуре 20 г/л. 1) Какова объёмная производительность по биомассе? 2) Сколько тонн биомассы ферментёр даёт за сутки? 3) Что произойдёт, если в культуре появится мутант, растущий на 5 % быстрее, но не дающий продукта?

Задание 13 (олимпиадное)

Мутант коринебактерии не синтезирует гомосерин и потому нуждается в треонине и метионине. В среду с ограниченным количеством треонина он выделяет много лизина. 1) Что произойдёт с выделением лизина, если добавить в среду избыток треонина? Объясните. 2) Как можно получить мутанта, выделяющего лизин и при избытке треонина?

Литература

• ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы среднего общего образования и элементов содержания для проведения единого государственного экзамена по биологии, 2027 г.
• Glick B. R., Patten C. L. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 6th ed. ASM Press, 2022.
• Madigan M. T., Bender K. S., Buckley D. H., Sattley W. M., Stahl D. A. Brock Biology of Microorganisms. 16th ed. Pearson, 2021.
• Stanbury P. F., Whitaker A., Hall S. J. Principles of Fermentation Technology. 3rd ed. Butterworth-Heinemann, 2017.
• Waites M. J., Morgan N. L., Rockey J. S., Higton G. Industrial Microbiology: An Introduction. Blackwell Science, 2001.
• Kinoshita S., Udaka S., Shimono M. Studies on the amino acid fermentation. Part I. Production of L-glutamic acid by various microorganisms // Journal of General and Applied Microbiology. 1957. Vol. 3. P. 193–205.
• Nakayama K., Kitada S., Kinoshita S. Studies on lysine fermentation. I. The control mechanism on lysine accumulation by homoserine and threonine // Journal of General and Applied Microbiology. 1961. Vol. 7. P. 145–154.
• Kalinowski J. et al. The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins // Journal of Biotechnology. 2003. Vol. 104. P. 5–25.
• Wendisch V. F. Metabolic engineering advances and prospects for amino acid production // Metabolic Engineering. 2020. Vol. 58. P. 17–34.
• Becker J., Wittmann C. Bio-based production of chemicals, materials and fuels — Corynebacterium glutamicum as versatile cell factory // Current Opinion in Biotechnology. 2012. Vol. 23. P. 631–640.
• Litchfield J. H. Single-cell proteins // Science. 1983. Vol. 219. P. 740–746.
• Ritala A., Häkkinen S. T., Toivari M., Wiebe M. G. Single cell protein — state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001–2016 // Frontiers in Microbiology. 2017. Vol. 8. 2009.
• Wiebe M. G. Myco-protein from Fusarium venenatum: a well-established product for human consumption // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. Vol. 58. P. 421–427.
• Martens J.-H., Barg H., Warren M. J., Jahn D. Microbial production of vitamin B₁₂ // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. Vol. 58. P. 275–285.
• Woodward R. B. The total synthesis of vitamin B₁₂ // Pure and Applied Chemistry. 1973. Vol. 33. P. 145–177.
• Schwechheimer S. K., Park E. Y., Revuelta J. L., Becker J., Wittmann C. Biotechnology of riboflavin // Applied Microbiology and Biotechnology. 2016. Vol. 100. P. 2107–2119.
• Currie J. N. The citric acid fermentation of Aspergillus niger // Journal of Biological Chemistry. 1917. Vol. 31. P. 15–37.