Искусственный синтез гена и конструирование рекомбинантных ДНК

В 1982 году в аптеках появился первый лекарственный белок, сделанный бактерией: инсулин человека. Ген инсулина взяли не из человека — его синтезировали химически, нуклеотид за нуклеотидом, встроили в кольцевую молекулу ДНК бактерии и ввели в кишечную палочку. С тех пор так получают гормоны, вакцины, ферменты, а синтезировать научились уже не отдельные гены, а целые геномы. Основа всего этого — две операции: искусственный синтез гена и конструирование рекомбинантной ДНК.

В этой статье разобрано с самого начала: что такое рекомбинантная ДНК и генная инженерия, как получить нужный ген (выделить из генома, переписать с мРНК, синтезировать химически), какие ферменты служат «ножницами» и «клеем», что такое вектор и плазмида, как соединить ген с вектором, ввести его в клетку, отобрать нужные клоны и заставить ген работать. В кодификаторе ЕГЭ по биологии 2027 года тема входит в элемент 3.7: «Хромосомная и генная инженерия. Искусственный синтез гена и конструирование рекомбинантных ДНК». В конце — что писать на ЕГЭ, раздел для олимпиад и 13 заданий с разбором.

• Что такое генная инженерия и рекомбинантная ДНК
• Слова, которые понадобятся
• Как получить ген
• Выделение гена из генома
• Обратная транскрипция: кДНК
• Химический синтез гена
• Ножницы и клей: рестриктазы и лигаза
• Векторы
• Конструирование рекомбинантной ДНК шаг за шагом
• Как ввести ДНК в клетку
• Как отобрать нужные клоны
• Как заставить ген работать
• Пример: инсулин
• Хромосомная инженерия
• Безопасность
• История
• Удивительные факты
• Что писать на ЕГЭ
• Для олимпиад
• Задания с разбором

Что такое генная инженерия и рекомбинантная ДНК

В природе гены тоже переходят от одного организма к другому: бактерии обмениваются плазмидами, вирусы переносят куски ДНК хозяина. Генная инженерия делает это направленно. Исследователь сам выбирает ген, сам решает, в какой организм его ввести, и может изменить ген перед этим.

Все методы генной инженерии опираются на то, что генетический код и строение ДНК у всех организмов одинаковы. Поэтому бактерия «читает» ген человека и синтезирует по нему белок человека — если ген подготовлен так, чтобы бактерия могла его прочитать.

Слова, которые понадобятся

• Ген — участок ДНК, в котором закодирована последовательность аминокислот белка (или молекула РНК). У эукариот в гене чередуются экзоны (кодирующие участки) и интроны (некодирующие вставки, которые вырезаются из РНК при созревании — сплайсинге).
• Промотор — участок перед геном, к которому присоединяется РНК-полимераза и с которого начинается транскрипция.
• кДНК (комплементарная ДНК) — ДНК, синтезированная на матрице мРНК; в ней нет интронов.
• Рестриктаза (рестрикционная эндонуклеаза) — фермент, разрезающий ДНК в участке с определённой последовательностью нуклеотидов (сайте узнавания).
• ДНК-лигаза — фермент, сшивающий фрагменты ДНК.
• Вектор — молекула ДНК, способная переносить чужой ген в клетку и размножаться в ней: плазмида, ДНК вируса.
• Плазмида — небольшая кольцевая молекула ДНК бактерии, существующая отдельно от хромосомы и способная самостоятельно копироваться.
• Трансформация — поглощение клеткой чужой ДНК. Клон — потомство одной клетки; клонирование гена — получение множества копий клеток с одним и тем же встроенным геном.
• Экспрессия гена — работа гена: транскрипция и трансляция, в результате которых образуется белок.

Как получить ген

Первый шаг — получить нужный ген в виде отдельного фрагмента ДНК. Для этого есть три пути.

Выделение гена из генома

ДНК клетки разрезают рестриктазами на фрагменты и ищут среди них нужный: по метке-зонду (меченой цепочке, комплементарной гену), по размеру или по признаку, который фрагмент даёт бактерии. Так поступали в 1970-х годах, и для генов бактерий этот путь годится и сейчас. Но гены эукариот часто во много раз длиннее, чем нужно для белка, из-за интронов: ген фактора свёртывания крови VIII человека занимает около 186 тысяч пар нуклеотидов, а кодирующая часть — около 7 тысяч. Бактерия не умеет вырезать интроны, поэтому по такому гену правильного белка не синтезирует.

Обратная транскрипция: кДНК

В 1970 году Говард Темин и Дэвид Балтимор независимо открыли у ретровирусов фермент обратную транскриптазу (ревертазу), который синтезирует ДНК на матрице РНК (Temin, Mizutani, 1970; Baltimore, 1970). Это нарушало прежнее представление, что информация всегда идёт от ДНК к РНК, и стало одним из главных инструментов генной инженерии.

Из клеток, где нужный ген активно работает (например, из клеток поджелудочной железы — для инсулина), выделяют мРНК. Она уже прошла сплайсинг, интронов в ней нет. Обратная транскриптаза строит на мРНК комплементарную цепь ДНК, затем РНК разрушают, и ДНК-полимераза достраивает вторую цепь. Получается двуцепочечная кДНК — копия гена без интронов, которую бактерия может прочитать.

Химический синтез гена

Если известна последовательность аминокислот белка или нуклеотидов гена, ген можно синтезировать химически. Первым это сделал Хар Гобинд Корана: в 1970 году его группа синтезировала ген аланиновой тРНК дрожжей длиной 77 пар нуклеотидов (Agarwal и соавторы, 1970). Работа заняла пять лет: короткие цепочки синтезировали вручную и сшивали лигазой.

Сейчас синтез олигонуклеотидов (коротких одноцепочечных фрагментов) идёт в автоматах фосфорамидитным методом (Beaucage, Caruthers, 1981). Нуклеотиды присоединяются по одному к растущей цепи, закреплённой на твёрдом носителе, в повторяющемся цикле из четырёх химических реакций. На каждом шаге небольшая доля цепей не удлиняется, поэтому длинные цепи получаются с ошибками и в малом выходе; практический предел — около 200 нуклеотидов. Ген собирают из перекрывающихся олигонуклеотидов: они спариваются, и щели заполняет полимераза или сшивает лигаза. Распространённый способ сборки — метод Гибсона: фрагменты с перекрывающимися концами соединяются в одной пробирке смесью трёх ферментов (Gibson и соавторы, 2009).

У химического синтеза есть важное преимущество: можно задать любую последовательность. Генетический код вырожден — большинство аминокислот кодируется несколькими кодонами, и разные организмы предпочитают разные кодоны. При синтезе гена человека для бактерии подбирают кодоны, которые бактерия читает быстро, — это называют оптимизацией кодонов. Можно также убрать неудобные сайты рестрикции, добавить метки для очистки белка, изменить аминокислоты.

Синтезируют не только гены. В 2010 году в лаборатории Крейга Вентера синтезировали весь геном бактерии Mycoplasma mycoides — около 1,08 млн пар нуклеотидов — и пересадили его в клетку другого вида; клетка стала размножаться под управлением синтетического генома (Gibson и соавторы, 2010). В 2016 году получили клетку с минимальным синтетическим геномом из 473 генов (Hutchison и соавторы, 2016).

Ножницы и клей: рестриктазы и лигаза

Рестриктазы бактерии используют для защиты от вирусов: фермент разрезает чужую ДНК, а свою бактерия защищает, метилируя те же участки. Первую рестриктазу, режущую ДНК в строго определённом месте, выделил Гамильтон Смит в 1970 году (Smith, Wilcox, 1970); за открытие рестриктаз В. Арбер, Г. Смит и Д. Натанс получили Нобелевскую премию 1978 года.

Сайт узнавания большинства рестриктаз — палиндром длиной 4–8 пар нуклеотидов: последовательность одной цепи, прочитанная от 5′ к 3′, совпадает с последовательностью другой цепи, тоже прочитанной от 5′ к 3′. Например, рестриктаза EcoRI (из кишечной палочки) узнаёт GAATTC.

Разные рестриктазы режут по-разному. EcoRI режет обе цепи со сдвигом, и на концах фрагментов остаются короткие одноцепочечные участки — липкие концы. Они комплементарны у всех фрагментов, разрезанных одним и тем же ферментом, и поэтому легко спариваются. Другие рестриктазы (например, SmaI, узнающая CCCGGG) режут обе цепи напротив друг друга и оставляют тупые концы; соединять их труднее.

ДНК-лигаза восстанавливает фосфодиэфирную связь между соседними нуклеотидами, сшивая разрывы в сахарофосфатном остове. Так спарившиеся липкими концами фрагменты превращаются в одну непрерывную молекулу. В генной инженерии чаще всего используют лигазу бактериофага T4: она сшивает и липкие, и тупые концы.

Ген перед встраиванием обычно размножают в полимеразной цепной реакции; для этого используют термостабильную Taq-полимеразу. Направленно изменять гены прямо в хромосоме позволяет система CRISPR-Cas9.

Векторы

Отдельный фрагмент ДНК, попав в клетку, не копируется и быстро разрушается. Чтобы ген размножался вместе с клеткой, его встраивают в вектор — молекулу ДНК, которая умеет сама копироваться в клетке-хозяине.

Хороший вектор должен иметь: 1) точку начала репликации (ori), чтобы копироваться; 2) маркерный ген, по которому можно отобрать клетки с вектором, — обычно ген устойчивости к антибиотику; 3) уникальные сайты рестрикции, где вектор можно разрезать и вставить ген, не разрушив нужных участков; 4) для получения белка — промотор, с которого будет транскрибироваться встроенный ген. Классический вектор pBR322 (1977) нёс гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину (Bolivar и соавторы, 1977); векторы серии pUC добавили полилинкер внутри гена-индикатора lacZ′ (Yanisch-Perron и соавторы, 1985).

Конструирование рекомбинантной ДНК шаг за шагом

Ключевой момент — шаг 3. Вектор и ген режут одной и той же рестриктазой (или ферментами, дающими совместимые концы), поэтому их липкие концы комплементарны. При смешивании концы спариваются водородными связями, а лигаза сшивает остов. Получается кольцевая рекомбинантная плазмида со встроенным геном. Если вектор и ген разрезать двумя разными рестриктазами — по одной с каждой стороны, — ген встанет только в одной ориентации; это называют направленным клонированием.

Впервые рекомбинантную ДНК получил Пол Берг в 1972 году, соединив ДНК обезьяньего вируса SV40 и бактериофага λ (Jackson и соавторы, 1972). В 1973 году Стэнли Коэн и Герберт Бойер встроили фрагмент ДНК в плазмиду, ввели её в кишечную палочку и показали, что чужой ген копируется вместе с плазмидой и передаётся потомкам бактерии (Cohen и соавторы, 1973). Эту дату считают рождением генной инженерии.

Как ввести ДНК в клетку

• Химическая трансформация бактерий. Клетки кишечной палочки обрабатывают холодным раствором хлорида кальция и кратко нагревают до 42 °C (тепловой шок): мембрана становится проницаемой для плазмид (Mandel, Higa, 1970; Cohen и соавторы, 1972).
• Электропорация — короткий электрический импульс открывает поры в мембране; годится для бактерий, дрожжей, клеток животных и растений.
• Трансфекция клеток животных — ДНК вводят в комплексе с липидами или с помощью вирусных векторов.
• Микроинъекция — ДНК вводят тонкой иглой прямо в ядро оплодотворённой яйцеклетки; так получают трансгенных животных.
• Агробактерия переносит участок своей Ti-плазмиды в хромосому растения; в этот участок встраивают нужный ген.
• Генная пушка — микроскопические частицы золота, покрытые ДНК, «выстреливают» в клетки растения.

Как отобрать нужные клоны

Трансформация малоэффективна: плазмиду поглощает лишь малая доля клеток, а среди плазмид часть замкнулась без вставки. Поэтому клетки отбирают в два приёма.

1. Отбор на антибиотике. Бактерии высевают на среду с антибиотиком, например ампициллином. Выживают только клетки, получившие плазмиду с геном устойчивости.
2. Сине-белый отбор. Если полилинкер лежит внутри гена lacZ′, то вставка гена разрушает его. На среде с бесцветным веществом X-gal колонии с целым геном lacZ′ становятся синими (фермент β-галактозидаза расщепляет X-gal до синего красителя), а колонии с рекомбинантной плазмидой остаются белыми.

Белые колонии проверяют: выделяют плазмиду и определяют длину вставки рестрикционным анализом или ПЦР, а последовательность — секвенированием.

Как заставить ген работать

Ген в плазмиде ещё не значит белок. Чтобы ген эукариот работал в бактерии, нужно учесть различия в устройстве генов (Glick, Patten, 2022).

• Интроны — бактерия их не вырезает, поэтому используют кДНК или синтетический ген.
• Промотор — бактериальная РНК-полимераза не узнаёт промоторы эукариот; ген ставят под бактериальный промотор, часто регулируемый (например, включаемый добавкой вещества в среду).
• Начало трансляции — перед стартовым кодоном нужен участок связывания рибосомы бактерии (последовательность Шайна — Дальгарно).
• Кодоны — редкие для бактерии кодоны замедляют синтез; их заменяют синонимичными.
• Посттрансляционные изменения — бактерии не образуют многих дисульфидных мостиков и не присоединяют углеводные цепи. Белки, которым это нужно, получают в дрожжах или клетках млекопитающих (см. статью «Объекты биотехнологии»).

Небольшие белки бактерия быстро разрушает, поэтому их часто синтезируют как часть гибридного белка с крупным белком бактерии, а затем вырезают.

Пример: инсулин

Инсулин человека — белок из двух цепей: A (21 аминокислота) и B (30 аминокислот), связанных дисульфидными мостиками. В организме он образуется из длинного предшественника, проинсулина, из которого ферменты вырезают средний участок, C-пептид. Бактерия этого сделать не может.

Поэтому в 1978 году в компании Genentech поступили так (Goeddel и соавторы, 1979):

1. химически синтезировали два гена — для цепи A и для цепи B (63 и 90 пар нуклеотидов кодирующей части), подобрав кодоны;
2. каждый ген встроили в плазмиду вслед за геном бактериального фермента β-галактозидазы, отделив их кодоном метионина;
3. две разные культуры кишечной палочки синтезировали гибридные белки; цепи A и B отрезали от них бромцианом, разрывающим цепь после метионина;
4. цепи смешали и окислили — образовались дисульфидные мостики, и получился инсулин человека.

В 1982 году этот инсулин поступил в продажу. Позже стали синтезировать проинсулин и превращать его в инсулин ферментами, а также производить инсулин в дрожжах.

Хромосомная инженерия

Если генная инженерия работает с отдельными генами, то хромосомная инженерия — с целыми хромосомами и их крупными участками. Это получение полиплоидов, замещение или добавление хромосом одного вида в набор другого (например, перенос участка хромосомы ржи в пшеницу, давший устойчивость к болезням), получение гаплоидов и линий с изменённым числом хромосом. Хромосомную инженерию подробнее разберём в отдельной статье.

Безопасность

Возможность переносить гены между любыми организмами встревожила самих учёных. В 1974 году Пол Берг и коллеги призвали временно отказаться от рискованных опытов, а в 1975 году на конференции в Асиломаре (Калифорния) выработали правила: уровни защиты лабораторий в зависимости от риска и использование ослабленных штаммов бактерий, не способных жить вне лаборатории (Berg и соавторы, 1975). Эти правила легли в основу современного регулирования. Использование генно-инженерных организмов в сельском хозяйстве и медицине сейчас регулируется законами разных стран, и каждый продукт проходит отдельную оценку безопасности.

История

Генная инженерия возникла из трёх открытий конца 1960-х — начала 1970-х годов: ферментов, режущих и сшивающих ДНК; фермента, переписывающего РНК в ДНК; и умения синтезировать ДНК химически. За три года, с 1970 по 1973-й, появились первый синтетический ген, первая рекомбинантная ДНК и первая бактерия с чужим геном. Через пять лет бактерии уже производили гормоны человека, а через сорок лет удалось синтезировать целый геном.

Удивительные факты

• Пять лет на 77 пар. Первый синтетический ген Кораны собирали пять лет. Сейчас автомат синтезирует такой фрагмент за несколько часов, а гены длиной в тысячи пар заказывают по почте.
• Водяные знаки в ДНК. В синтетический геном микоплазмы 2010 года вписали «водяные знаки» — закодированные нуклеотидами имена авторов, адрес электронной почты и цитаты.
• Ген без интронов. Человеческий ген дистрофина занимает около 2,2 млн пар нуклеотидов, а его мРНК — около 14 тысяч: почти всё остальное — интроны.
• Бактериальная защита стала инструментом. Рестриктазы, CRISPR-Cas9, обратная транскриптаза — все главные инструменты генной инженерии изначально служили бактериям и вирусам в их «войне» друг с другом.

Что писать на ЕГЭ

Опорные формулировки:

• Генная инженерия — методы получения рекомбинантных ДНК и введения их в клетки для получения организмов с новыми свойствами.
• Рекомбинантная ДНК — молекула ДНК, составленная из фрагментов ДНК разного происхождения.
• Ген получают: выделением из ДНК с помощью рестриктаз; обратной транскрипцией с мРНК (кДНК без интронов); химическим синтезом.
• Рестриктазы разрезают ДНК в определённых участках, образуя липкие концы; ДНК-лигаза сшивает фрагменты.
• Вектор (плазмида, ДНК вируса) переносит ген в клетку и обеспечивает его копирование; в векторе есть ген-маркер (устойчивость к антибиотику).
• Этапы: получение гена → встраивание в вектор (рестриктазы и лигаза) → введение в клетку → отбор клеток с рекомбинантной ДНК → размножение клона и получение продукта.
• Примеры: инсулин, гормон роста, интерферон, вакцина против гепатита B, трансгенные растения.

Для тренировки — тема 3.7 в тренажёре ЕГЭ по биологии.

Для олимпиад

Как часто встречается сайт рестрикции

Если нуклеотиды расположены случайно и все четыре встречаются одинаково часто, то конкретная последовательность длиной n встречается в среднем один раз на 4ⁿ пар нуклеотидов: сайт из 4 пар — раз на 256, из 6 пар — раз на 4096, из 8 пар — раз на 65 536. Реальные частоты отличаются: например, в ДНК фага λ (48 502 пары) сайтов EcoRI всего 5 вместо ожидаемых ~12, а в геномах многих бактерий сайты собственных рестриктаз редки — отбор их «вычищает».

Совместимые концы

Разные рестриктазы могут давать одинаковые липкие концы. BamHI режет G^GATCC, BglII — A^GATCT; оба оставляют концы GATC и могут быть сшиты друг с другом. Но получившийся гибридный сайт (GGATCT или AGATCC) уже не узнаёт ни один из этих ферментов — этим пользуются, чтобы вставка не вырезалась обратно.

Выход синтеза олигонуклеотидов

Если на каждом шаге присоединяется доля p цепей, то полной длины n достигнет доля pⁿ⁻¹ цепей. При p = 0,995 для 100-звенной цепи это около 61 %, для 200-звенной — около 37 %. Поэтому длинные гены собирают из коротких фрагментов, а не синтезируют целиком.

Обратная трансляция

Число последовательностей ДНК, кодирующих данный белок, равно произведению чисел кодонов для каждой аминокислоты. Для гормона соматостатина из 14 аминокислот (Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys) оно составляет 393 216 — и это без учёта стартового и стоп-кодонов.

Задания с разбором

Задания 1–9 — в формате ЕГЭ (с элементами ответа для заданий с развёрнутым ответом), 10–13 — олимпиадные.

Задание 1

Выберите три фермента, которые используют для конструирования рекомбинантной ДНК.

1. рестриктаза
2. амилаза
3. ДНК-лигаза
4. пепсин
5. обратная транскриптаза
6. каталаза

Задание 2

Установите соответствие между инструментами генной инженерии и их функциями.

ИНСТРУМЕНТЫ: А) рестриктаза; Б) ДНК-лигаза; В) обратная транскриптаза; Г) плазмида; Д) ген устойчивости к антибиотику; Е) термостабильная ДНК-полимераза.

ФУНКЦИИ: 1) разрезание ДНК в определённом участке; 2) сшивание фрагментов ДНК; 3) синтез ДНК на матрице РНК; 4) перенос гена в клетку и его копирование; 5) отбор клеток, получивших вектор; 6) размножение гена в ПЦР.

Задание 3

Установите последовательность этапов получения бактерии, синтезирующей белок человека.

1. введение рекомбинантной плазмиды в клетки бактерий
2. получение кДНК на матрице мРНК
3. сшивание гена с плазмидой ДНК-лигазой
4. отбор колоний на среде с антибиотиком
5. разрезание плазмиды и гена одной рестриктазой

Задание 4

Почему ген белка человека, вырезанный из хромосомы, обычно не может работать в клетке бактерии? Как обходят это препятствие?

Задание 5

Что такое липкие концы? Почему вектор и встраиваемый ген разрезают одной и той же рестриктазой?

Задание 6

Зачем в плазмиде-векторе ген устойчивости к антибиотику и как с его помощью отбирают нужные бактерии?

Задание 7

Найдите три ошибки в приведённом тексте. Укажите номера предложений, в которых сделаны ошибки, исправьте их.

(1) Рекомбинантная ДНК состоит из фрагментов ДНК разного происхождения. (2) ДНК-лигаза разрезает ДНК в участках с определённой последовательностью нуклеотидов. (3) Обратная транскриптаза синтезирует РНК на матрице ДНК. (4) кДНК, полученная на матрице мРНК, не содержит интронов. (5) Плазмида — кольцевая молекула ДНК, входящая в состав хромосомы бактерии. (6) Для отбора клеток с вектором используют ген устойчивости к антибиотику.

Задание 8

Почему в 1978 году инсулин человека получали, синтезируя отдельно гены цепей A и B, а не ген проинсулина?

Задание 9

Назовите не менее трёх преимуществ химического синтеза гена перед выделением гена из ДНК клетки.

Задание 10 (олимпиадное)

1) Как часто в среднем встречается в случайной ДНК сайт рестриктазы длиной 6 пар нуклеотидов? Длиной 4 пары? 2) На сколько фрагментов в среднем разрежет 6-нуклеотидная рестриктаза геном человека (3,1 · 10⁹ пар нуклеотидов)? 3) В ДНК фага λ (48 502 пары) сайтов EcoRI всего 5. Сколько их ожидалось бы при случайном расположении нуклеотидов?

Задание 11 (олимпиадное)

Соматостатин — пептид из 14 аминокислот: Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys. Число кодонов: Ala — 4, Gly — 4, Cys — 2, Lys — 2, Asn — 2, Phe — 2, Trp — 1, Thr — 4, Ser — 6. 1) Сколько разных последовательностей ДНК может кодировать этот пептид (без стартового и стоп-кодонов)? 2) Сколько — если добавить стартовый метионин (1 кодон) и стоп-кодон (3 варианта)? 3) Почему химику, синтезирующему ген, это обстоятельство полезно?

Задание 12 (олимпиадное)

Синтез олигонуклеотидов идёт с эффективностью присоединения 99,5 % на шаг. 1) Какая доля цепей достигнет полной длины для 60-, 100- и 200-звенных олигонуклеотидов? 2) Почему ген длиной 1000 пар нуклеотидов не синтезируют одной цепью?

Задание 13 (олимпиадное)

Рестриктаза BamHI режет G^GATCC, BglII — A^GATCT (знак ^ — место разреза верхней цепи; нижняя режется симметрично). 1) Какие липкие концы образуют эти ферменты? 2) Можно ли сшить фрагмент, вырезанный BglII, с плазмидой, разрезанной BamHI? 3) Какая последовательность получится в месте соединения и разрежет ли её какой-нибудь из двух ферментов?

Литература

• ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы среднего общего образования и элементов содержания для проведения единого государственного экзамена по биологии, 2027 г.
• Alberts B. et al. Molecular Biology of the Cell. 7th ed. W. W. Norton, 2022.
• Glick B. R., Patten C. L. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 6th ed. ASM Press, 2022.
• Watson J. D., Caudy A. A., Myers R. M., Witkowski J. A. Recombinant DNA: Genes and Genomes — A Short Course. 3rd ed. W. H. Freeman, 2007.
• Green M. R., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012.
• Agarwal K. L. et al. Total synthesis of the gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast // Nature. 1970. Vol. 227. P. 27–34.
• Temin H. M., Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus // Nature. 1970. Vol. 226. P. 1211–1213.
• Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses // Nature. 1970. Vol. 226. P. 1209–1211.
• Smith H. O., Wilcox K. W. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties // Journal of Molecular Biology. 1970. Vol. 51. P. 379–391.
• Mandel M., Higa A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection // Journal of Molecular Biology. 1970. Vol. 53. P. 159–162.
• Cohen S. N., Chang A. C. Y., Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA // PNAS. 1972. Vol. 69. P. 2110–2114.
• Jackson D. A., Symons R. H., Berg P. Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40 // PNAS. 1972. Vol. 69. P. 2904–2909.
• Cohen S. N., Chang A. C. Y., Boyer H. W., Helling R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro // PNAS. 1973. Vol. 70. P. 3240–3244.
• Berg P., Baltimore D., Brenner S., Roblin R. O., Singer M. F. Summary statement of the Asilomar conference on recombinant DNA molecules // PNAS. 1975. Vol. 72. P. 1981–1984.
• Bolivar F. et al. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system // Gene. 1977. Vol. 2. P. 95–113.
• Itakura K. et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin // Science. 1977. Vol. 198. P. 1056–1063.
• Goeddel D. V. et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin // PNAS. 1979. Vol. 76. P. 106–110.
• Beaucage S. L., Caruthers M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites — a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis // Tetrahedron Letters. 1981. Vol. 22. P. 1859–1862.
• Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors // Gene. 1985. Vol. 33. P. 103–119.
• Gibson D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases // Nature Methods. 2009. Vol. 6. P. 343–345.
• Gibson D. G. et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome // Science. 2010. Vol. 329. P. 52–56.
• Hutchison C. A. et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome // Science. 2016. Vol. 351. aad6253.
• Kosuri S., Church G. M. Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications // Nature Methods. 2014. Vol. 11. P. 499–507.