Репликация ДНК: комплементарность, антипараллельность и опыт Мезельсона — Сталя

25 апреля 1953 года журнал Nature опубликовал статью Джеймса Уотсона и Фрэнсиса Крика на одну страницу с моделью двойной спирали ДНК [1]. В конце статьи авторы сдержанно заметили, что предложенное ими спаривание оснований сразу подсказывает возможный механизм копирования генетического материала. Через месяц в той же Nature они изложили свою идею подробно: две цепи расходятся, и на каждой строится новая, комплементарная [2]. Идея была простой и красивой, но оставалась гипотезой ещё пять лет — пока двое молодых сотрудников Калифорнийского технологического института не поставили опыт, который называют «самым красивым экспериментом в биологии».

Это вторая статья серии о клеточном цикле и делении клетки (начало — «Клеточный цикл и интерфаза»). В ней разобраны принципы репликации ДНК: комплементарность, антипараллельность и полуконсервативный синтез, — а также опыты, которыми их доказали. Ферменты репликации и устройство вилки — тема следующей статьи серии, «Механизм репликации ДНК».

• 1. Что такое репликация
• 2. Путь к двойной спирали
• 3. Что нужно знать о строении ДНК
• 4. Комплементарность
• 5. Правило Чаргаффа
• 6. Антипараллельность и направление синтеза
• 7. Откуда берутся нуклеотиды для репликации
• 8. Без 3′-конца цепь обрывается: секвенирование и лекарства
• 9. Три гипотезы
• 10. Опыт Мезельсона и Сталя
• 11. Полуконсервативно реплицируются и хромосомы
• 12. Как увидели реплицирующуюся хромосому
• 13. Репликация в пробирке
• 14. Значение репликации и судьба хромосом
• 15. Ошибки репликации и эволюция
• 16. Репликация в цифрах
• 17. Репликация у вирусов и органоидов
• 18. Репликация в пробирке: ПЦР
• 19. Как метят ДНК
• 20. Итог: принципы репликации
• 21. Частые ошибки
• 22. Интересные факты
• 23. Частые вопросы
• 24. ЕГЭ
• 25. Для олимпиад
• 26. Задания с разбором
• Литература

1. Что такое репликация

Репликация (или редупликация) — удвоение молекулы ДНК: на каждой цепи исходной молекулы строится новая цепь, комплементарная ей. В результате из одной двуцепочечной молекулы получаются две дочерние, одинаковые с исходной по последовательности нуклеотидов.

Репликация — одна из реакций матричного синтеза. Порядок нуклеотидов в новой цепи определяет не фермент, а уже существующая цепь — матрица. Той же особенностью отличаются транскрипция и трансляция (подробнее — в статье «Матричный синтез и реализация наследственной информации»). Но продукт репликации — ДНК, и нужна она перед каждым делением клетки: дочерняя клетка получит полный набор генов, только если ДНК была удвоена заранее.

2. Путь к двойной спирали

Саму ДНК открыл в 1869 году швейцарский врач Фридрих Мишер. Работая в Тюбингене, он выделял вещества из ядер лейкоцитов, которые получал из гноя на хирургических повязках, и нашёл новое вещество, богатое фосфором, — «нуклеин». Он даже предполагал, что нуклеин может быть связан с наследственностью, но доказать это тогда было невозможно.

До середины XX века большинство биологов считали носителями наследственности белки: они разнообразны, а ДНК казалась слишком простой — всего четыре разных нуклеотида. Перелом произошёл в 1944 году. Американские исследователи Освальд Эйвери, Колин Маклеод и Маклин Маккарти показали, что «трансформирующее начало», способное превращать безвредных пневмококков в болезнетворных, — это ДНК [3]. В 1952 году Альфред Херши и Марта Чейз с помощью радиоактивных меток доказали, что бактериофаг вводит в бактерию именно ДНК, а белковая оболочка остаётся снаружи [4].

Оставалось понять, как устроена ДНК. Важные подсказки дали химические анализы и рентгеновские снимки. Австро-американский биохимик Эрвин Чаргафф установил, что в ДНК любого организма количество аденина равно количеству тимина, а гуанина — цитозину [5]. Рентгенограммы Розалинд Франклин и Рэймонда Гослинга показывали, что молекула — спираль с постоянным диаметром [6]. Уотсон и Крик соединили эти данные в модель: две цепи, закрученные одна вокруг другой, сахарофосфатный остов снаружи, азотистые основания внутри, причём аденин всегда стоит напротив тимина, а гуанин — напротив цитозина [1].

Розалинд Франклин умерла от рака в 1958 году в 37 лет, а Нобелевскую премию 1962 года за открытие структуры ДНК получили Уотсон, Крик и Морис Уилкинс. Нобелевскую премию не присуждают посмертно, но вклад Франклин сегодня признаётся одним из ключевых.

Как Уотсон и Крик ошибались — и угадали

Путь к модели не был прямым. В начале 1953 года величайший химик того времени Лайнус Полинг опубликовал свою модель ДНК — тройную спираль, в которой фосфатные группы находились внутри, а основания торчали наружу [7]. Модель оказалась ошибочной: фосфаты в воде несут отрицательный заряд и отталкивались бы друг от друга в тесной середине молекулы. Уотсон и Крик сами в конце 1951 года построили похожую неверную модель, и Франклин, увидев её, сразу указала им на ошибку: модель противоречила данным о содержании воды в образцах ДНК.

Решающая подсказка пришла от американского кристаллографа Джерри Донохью, работавшего в той же кембриджской комнате. Уотсон пытался спаривать основания, нарисованные так, как в тогдашних учебниках, и пары не складывались. Донохью объяснил, что в учебниках у гуанина и тимина изображены неправильные формы — с атомом водорода не на том месте. Уотсон вырезал из картона основания в правильных формах — и увидел, что пара аденин — тимин в точности совпадает по форме с парой гуанин — цитозин. Это объяснило и правило Чаргаффа, и постоянный диаметр спирали.

3. Что нужно знать о строении ДНК

Чтобы понять репликацию, достаточно нескольких фактов о строении ДНК.

• Нуклеотид состоит из азотистого основания (аденин, гуанин, цитозин или тимин), сахара дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты.
• Цепь ДНК — нуклеотиды, соединённые между собой: фосфат одного нуклеотида связан с сахаром соседнего. Остов цепи образуют чередующиеся сахар и фосфат, а основания торчат в сторону.
• Концы цепи различаются. Атомы углерода в дезоксирибозе нумеруют со штрихом: 1′, 2′, 3′, 4′, 5′. На одном конце цепи свободен фосфат при 5′-атоме — это 5′-конец, на другом свободна гидроксильная группа при 3′-атоме — 3′-конец. Поэтому у цепи есть направление, как у стрелки.
• Двойная спираль — две цепи, соединённые водородными связями между основаниями. Цепи антипараллельны: напротив 5′-конца одной цепи находится 3′-конец другой.

Связи внутри цепи (между сахаром и фосфатом) — прочные ковалентные, а связи между цепями — слабые водородные. Именно это делает возможной репликацию: цепи можно развести, не разрушая их самих, а затем использовать каждую как матрицу.

Размеры двойной спирали

Обычная форма ДНК в клетке — правозакрученная спираль диаметром около 2 нм. На один полный виток приходится примерно 10,5 пары нуклеотидов, а расстояние между соседними парами вдоль оси составляет 0,34 нм. Отсюда простой расчёт: участок ДНК из 1000 пар нуклеотидов имеет длину 1000 · 0,34 = 340 нм.

Две цепи закручены так, что между ними на поверхности спирали образуются две бороздки — широкая (большая) и узкая (малая). В большой бороздке края оснований открыты наружу, и каждая пара — А — Т, Т — А, Г — Ц или Ц — Г — выглядит по-своему. Поэтому белки, регулирующие работу генов, «читают» последовательность ДНК, не разводя цепи, — ощупывая большую бороздку. Для репликации же цепи приходится разводить полностью.

4. Комплементарность

Точность удвоения обеспечивается тем, что азотистые основания образуют пары только определённым образом. Аденин (А) спаривается с тимином (Т), образуя две водородные связи, а гуанин (Г) — с цитозином (Ц), образуя три. Такое соответствие называют комплементарностью — от латинского complementum, «дополнение».

Почему пары именно такие? Аденин и гуанин — крупные основания из двух колец (пурины), тимин и цитозин — мелкие, из одного кольца (пиримидины). В каждой паре одно крупное основание и одно мелкое, поэтому все пары одинаковой ширины и спираль имеет постоянный диаметр — как ступеньки одинаковой длины в верёвочной лестнице. А пары А — Т и Г — Ц, а не А — Ц и Г — Т, определяются расположением атомов, способных образовывать водородные связи: только в этих сочетаниях они встают точно друг напротив друга.

Каждая водородная связь слаба, поэтому цепи двойной спирали можно развести, не разрушая самих цепей. После разделения напротив каждого нуклеотида матрицы встаёт нуклеотид, образующий с ним комплементарную пару, и последовательность новой цепи оказывается однозначно предопределена. Если на матрице стоит А, в новую цепь встанет Т; если Г — встанет Ц, и наоборот.

Пример. Участок одной цепи ДНК: АТГЦЦАТТГАЦГ. Комплементарная цепь: ТАЦГГТААЦТГЦ. Пар А — Т здесь 6, пар Г — Ц тоже 6, и между цепями 6 · 2 + 6 · 3 = 30 водородных связей.

Когда комплементарность подводит

Уже во второй статье 1953 года Уотсон и Крик предположили, откуда при репликации могут браться мутации [2]. Атомы водорода в основаниях иногда на короткое время перескакивают на другое место, и основание переходит в редкую форму. В такой форме тимин может спариться не с аденином, а с гуанином, а цитозин — с аденином. Если именно в этот момент мимо проходит полимераза, в новую цепь встаёт неправильный нуклеотид, и после следующей репликации ошибка закрепляется в обеих цепях.

Другой источник ошибок — повторяющиеся участки ДНК, например ЦАГЦАГЦАГ… На таких участках новая цепь может временно отойти от матрицы и снова присоединиться со сдвигом на один повтор. В результате число повторов в дочерней молекуле увеличивается или уменьшается. Так возникают болезни «экспансии повторов»: при болезни Хантингтона у больных в одном из генов больше 36 повторов ЦАГ, тогда как у здоровых людей — обычно 10–30. Число повторов может нарастать от поколения к поколению, и болезнь у потомков начинается раньше.

5. Правило Чаргаффа

Из комплементарности вытекает правило, которое Чаргафф нашёл раньше, чем была открыта двойная спираль, — по результатам химического анализа ДНК разных организмов [5]. В двуцепочечной ДНК:

• количество аденина равно количеству тимина: А = Т;
• количество гуанина равно количеству цитозина: Г = Ц;
• следовательно, количество пуринов равно количеству пиримидинов: А + Г = Т + Ц.

Правило относится к молекуле в целом, а не к одной цепи. В одной цепи содержание А и Т обычно различается: каждому А этой цепи соответствует Т другой цепи. А вот отношение (А + Т) : (Г + Ц) правилу не подчиняется и характерно для вида. У человека пары Г — Ц составляют около 41 % всех пар, у некоторых бактерий — больше 70 %, у других — меньше 30 %.

У организмов с высоким содержанием пар Г — Ц двойная спираль прочнее: на каждую такую пару приходится три водородные связи вместо двух, к тому же пары Г — Ц сильнее взаимодействуют с соседними парами. Такая ДНК «плавится» — разделяется на цепи при нагревании — при более высокой температуре. Неудивительно, что у многих бактерий, живущих в горячих источниках, содержание Г — Ц в рибосомных РНК повышено.

Когда правило Чаргаффа не выполняется

В 1959 году американский биофизик Роберт Синсхаймер обнаружил, что в ДНК бактериофага φX174 количество аденина не равно количеству тимина. Объяснение оказалось простым: ДНК этого фага одноцепочечная [8]. Второй цепи нет, комплементарных пар нет, и правилу не на чем выполняться. Попав в бактерию, фаг сначала синтезирует на своей цепи комплементарную, и уже двуцепочечная форма служит матрицей для размножения. Так правило Чаргаффа стало способом отличать двуцепочечную ДНК от одноцепочечной.

6. Антипараллельность и направление синтеза

Две цепи двойной спирали антипараллельны: 5′-конец одной цепи расположен напротив 3′-конца другой. Это следует из геометрии: только при такой ориентации основания двух цепей встают друг против друга и образуют водородные связи.

Антипараллельность важна для репликации, потому что фермент ДНК-полимераза умеет удлинять цепь только с одного конца — присоединять новые нуклеотиды к гидроксильной группе на 3′-конце уже построенной цепи. Поэтому новая цепь всегда растёт в направлении 5′ → 3′, а матрица считывается в противоположном направлении — 3′ → 5′.

Правило записи простое: новая цепь комплементарна матрице и противоположна ей по ориентации. Если матрица записана от 5′ к 3′, новую цепь под ней надо подписать от 3′ к 5′. Ошибка в концах — одна из самых частых в задачах ЕГЭ.

Почему именно 5′ → 3′

Это не случайность, а следствие химии. Строительным материалом для синтеза служат дезоксирибонуклеозидтрифосфаты — нуклеотиды с тремя остатками фосфорной кислоты (как в АТФ, только с дезоксирибозой и разными основаниями: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ). Когда новый нуклеотид присоединяется к 3′-концу цепи, от него отщепляются два концевых фосфата, и энергия их отщепления идёт на образование связи. Энергию для каждого шага приносит сам новый нуклеотид.

Представим гипотетическую полимеразу, которая наращивала бы цепь в направлении 3′ → 5′. Тогда трифосфат находился бы не у входящего нуклеотида, а на конце растущей цепи. Если такой фермент встроил бы неверный нуклеотид и затем вырезал его, на конце цепи не осталось бы трифосфата — и синтез не смог бы продолжиться. При синтезе 5′ → 3′ ошибочный нуклеотид можно спокойно удалить: следующий нуклеотид принесёт энергию с собой. Иными словами, направление 5′ → 3′ — условие того, что полимераза может исправлять свои ошибки (подробнее — в статье «Механизм репликации ДНК»).

7. Откуда берутся нуклеотиды для репликации

Чтобы удвоить геном человека из 6,4 млрд пар нуклеотидов, клетке нужно около 12,8 млрд дезоксирибонуклеотидов: к каждой из двух старых цепей достраивается новая. Их она синтезирует сама, в основном в конце G₁ и в S-периоде. Исходный материал — рибонуклеотиды, те же, из которых строится РНК. Особый фермент, рибонуклеотидредуктаза, отнимает атом кислорода у 2′-атома углерода рибозы и превращает рибонуклеотид в дезоксирибонуклеотид. А тимидиловый нуклеотид получается из уридилового: другой фермент присоединяет к урацилу метильную группу, превращая его в тимин.

Количество четырёх дезоксирибонуклеотидов в клетке строго сбалансировано. Если одного из них станет слишком много или слишком мало, полимераза чаще будет ошибаться, встраивая «лишний» нуклеотид вместо недостающего. Поэтому рибонуклеотидредуктаза регулируется очень тонко: каждый нуклеотид влияет на синтез остальных.

На этих ферментах основано действие противоопухолевых препаратов, о которых говорилось в статье «Клеточный цикл и интерфаза». Фторурацил подавляет синтез тимидилового нуклеотида, метотрексат — восстановление вещества, необходимого для этого синтеза, а гидроксимочевина — рибонуклеотидредуктазу. Без нуклеотидов репликация останавливается, и клетка не может пройти S-период.

8. Без 3′-конца цепь обрывается: секвенирование и лекарства

Правило «полимераза присоединяет нуклеотид только к 3′-гидроксильной группе» легло в основу двух важнейших изобретений — метода чтения ДНК и противовирусных лекарств.

Метод Сэнгера

В 1977 году британский биохимик Фредерик Сэнгер придумал способ прочитать последовательность ДНК. Он добавлял в пробирку с матрицей, праймером, полимеразой и обычными нуклеотидами немного «испорченных» нуклеотидов — дидезоксинуклеотидов, у которых нет гидроксильной группы при 3′-атоме. Полимераза встраивает такой нуклеотид, как обычный, но присоединить к нему следующий уже не может: нет 3′-группы. Цепь обрывается.

Если «испорченного» аденилового нуклеотида немного, цепи обрываются в случайных местах напротив каждого тимина матрицы, и получается набор фрагментов разной длины. Сделав четыре реакции (по одной на каждый нуклеотид) и разделив фрагменты по длине, можно прочитать последовательность: по длинам фрагментов видно, где стоят А, где Г, Ц и Т. За этот метод Сэнгер в 1980 году получил вторую Нобелевскую премию по химии. Именно так в 1990–2003 годах прочитали геном человека.

Лекарства — «обрыватели цепи»

Тот же принцип используют лекарства против вирусов. Ацикловир, применяемый против вируса герпеса, похож на гуаниловый нуклеотид, но вместо дезоксирибозы у него незамкнутая цепочка без 3′-гидроксильной группы. Вирусный фермент встраивает его в ДНК, и синтез обрывается. Важно, что превращает ацикловир в «нуклеотид» фермент самого вируса, поэтому в незаражённых клетках лекарство почти не работает и мало вредит. Первое лекарство против ВИЧ — азидотимидин — тоже обрывает цепь ДНК, которую строит обратная транскриптаза вируса (подробнее — в статье «ВИЧ и СПИД»).

Как читают ДНК сегодня

Метод Сэнгера читал за один раз фрагмент длиной до тысячи нуклеотидов, и прочтение генома человека заняло 13 лет и стоило около трёх миллиардов долларов. Сегодня геном человека можно прочитать за сутки, и стоит это несколько сотен долларов. Большинство современных приборов по-прежнему используют полимеразу и комплементарность: миллионы фрагментов ДНК закрепляют на пластинке и достраивают по одному нуклеотиду, а каждый вид нуклеотида светится своим цветом. Камера фотографирует, какой цвет загорелся в каждой точке после очередного шага, — и так последовательно читает миллиарды нуклеотидов.

Другой подход совсем не использует синтез: одиночную цепь ДНК протягивают через крошечную пору в мембране, и каждое основание по-своему меняет проходящий через пору электрический ток. Такие нанопоровые приборы помещаются на ладони и читают фрагменты длиной в сотни тысяч нуклеотидов. Ими, в частности, следили за вариантами коронавируса прямо в больницах.

9. Три гипотезы

Комплементарность определяет состав новой цепи, но не говорит, как старые и новые цепи распределяются между дочерними молекулами. В середине 1950-х годов рассматривали три возможности.

• Консервативная репликация. Исходная молекула сохраняется целиком, а рядом с ней строится полностью новая молекула из двух новых цепей.
• Полуконсервативная репликация. Цепи исходной молекулы расходятся, и на каждой строится новая. Каждая дочерняя молекула состоит из одной старой и одной новой цепи. Именно такой способ предполагали Уотсон и Крик.
• Дисперсная репликация. Каждая цепь дочерних молекул составлена из участков старой и новой ДНК вперемешку. Эту гипотезу предложил физик Макс Дельбрюк: ему казалось невероятным, что две цепи, закрученные одна вокруг другой сотни тысяч раз, могут расплестись целиком без разрывов.

Сомнение Дельбрюка было серьёзным. Чтобы разделить две цепи ДНК бактерии длиной около 4,6 млн пар нуклеотидов, их нужно провернуть друг относительно друга примерно 440 тысяч раз — по одному обороту на каждые 10,5 пары. Как это возможно без запутывания, тогда никто не знал. Ответ — ферменты топоизомеразы, которые временно разрезают и вновь сшивают цепи, — нашли только в 1970-х годах.

10. Опыт Мезельсона и Сталя

Выбор между гипотезами в 1958 году сделали аспирант Мэтью Мезельсон и молодой исследователь Франклин Сталь [9]. Их идея заключалась в том, чтобы пометить старые цепи ДНК так, чтобы их можно было отличить от новых, — не радиоактивностью, а массой.

Как ставили опыт

1. Тяжёлая метка. Кишечную палочку много поколений выращивали на среде, где единственным источником азота был хлорид аммония с тяжёлым изотопом азота ¹⁵N. Азот входит в азотистые основания, и вся ДНК бактерий становилась «тяжёлой».
2. Перенос на лёгкую среду. Затем бактерии переносили на среду с обычным азотом ¹⁴N. Все новые цепи ДНК, синтезированные после переноса, были «лёгкими».
3. Пробы через каждое поколение. Число бактерий удваивалось примерно за 50 минут, и пробы брали через промежутки, соответствующие одному, двум, трём и более поколениям, выделяя из них ДНК.
4. Центрифугирование в градиенте плотности. ДНК смешивали с концентрированным раствором хлорида цезия и много часов вращали в ультрацентрифуге. Тяжёлые ионы цезия частично оседали, и в пробирке возникал градиент плотности — внизу раствор плотнее, вверху легче. Каждая молекула ДНК останавливалась в слое, плотность которого равна её собственной. Разница в плотности между «тяжёлой» и «лёгкой» ДНК — меньше 1 %, но метод её уверенно различал.
5. Фотографирование полос. ДНК сильно поглощает ультрафиолет, поэтому положение полос фотографировали в ультрафиолетовом свете прямо во вращающейся пробирке.

Что увидели

• Исходная ДНК (до переноса) — одна тяжёлая полоса.
• После первого деления на ¹⁴N — одна полоса промежуточной плотности.
• После второго деления — две полосы равной интенсивности: промежуточная и лёгкая.
• В следующих поколениях доля лёгкой ДНК росла, а промежуточная полоса сохранялась.

Логика опыта безупречна: уже после первого деления отпала консервативная гипотеза — тяжёлой полосы не было. После второго деления отпала дисперсная — полос стало две, а не одна. Осталась полуконсервативная. Мезельсон и Сталь сделали ещё одну проверку: нагрели гибридную ДНК и получили две разные «половинки» — тяжёлую и лёгкую; позже было доказано, что это и есть отдельные цепи. Значит, промежуточная молекула состоит из одной целой тяжёлой и одной целой лёгкой цепи, а не из перемешанных кусков.

Американский историк науки Фредерик Холмс назвал свою книгу об этом исследовании «Мезельсон, Сталь и репликация ДНК: история „самого красивого эксперимента в биологии“». Красота опыта — в простоте и однозначности: каждая гипотеза давала своё предсказание, и результат совпал только с одним из них.

11. Полуконсервативно реплицируются и хромосомы

Опыт Мезельсона и Сталя относился к бактериям. А как удваиваются хромосомы эукариот, в которых ДНК связана с белками? Ответ годом раньше получил американский цитолог Герберт Тейлор с соавторами [10]. Он выращивал корешки конского боба на среде с тимидином, меченным тритием, — радиоактивным изотопом водорода. Тимидин встраивается только в ДНК, и по засвечиванию фотоэмульсии над хромосомами можно увидеть, где находится меченая ДНК. Чтобы хромосомы не расходились по дочерним клеткам и их было удобно рассматривать, Тейлор добавлял колхицин, останавливающий митоз в метафазе.

Этот результат — прямое доказательство полуконсервативной репликации на уровне хромосом. Он означает также, что каждая хроматида содержит одну непрерывную двойную спираль ДНК: если бы хроматида состояла из многих разных молекул, метка распределялась бы не так чётко. Задачи, построенные на опыте Тейлора, встречаются в линии 27 ЕГЭ.

«Арлекиновые» хромосомы

В 1973 году американский генетик Сэмюэл Латт придумал более изящный способ увидеть то же самое без радиоактивности [11]. Клетки два цикла выращивают на среде с бромдезоксиуридином — аналогом тимидина, который клетка встраивает в ДНК вместо него. После двух репликаций в каждой хромосоме одна хроматида содержит одну «старую» цепь и одну цепь с аналогом, а другая — обе цепи с аналогом. При специальной окраске хроматиды окрашиваются по-разному: одна тёмная, другая светлая. Хромосомы становятся двухцветными, как костюм Арлекина.

На таких препаратах хорошо видны места, где сестринские хроматиды обменялись участками, — участок «перебегает» с тёмной хроматиды на светлую. Частота таких обменов резко возрастает под действием веществ, повреждающих ДНК. Поэтому подсчёт обменов сестринских хроматид используют для проверки, не вредно ли новое лекарство или вещество для наследственного аппарата.

12. Как увидели реплицирующуюся хромосому

В 1963 году британский биолог Джон Кернс выращивал кишечную палочку на среде с меченым тимидином, а затем очень бережно выделял её ДНК, чтобы не порвать длинную молекулу, и помещал на фотоэмульсию [12]. На снимках проявилось кольцо длиной больше миллиметра — в сотни раз длиннее самой бактерии. Реплицирующиеся молекулы имели характерную форму греческой буквы тета (θ): кольцо, внутри которого шла петля из уже удвоенной ДНК. Так было впервые показано, что хромосома бактерии кольцевая, реплицируется целиком как одна молекула и что в ней есть точки, где идёт синтез, — репликативные вилки.

Позже выяснилось, что репликация бактериальной хромосомы начинается в одной определённой точке и идёт от неё в обе стороны, двумя вилками. Вилки встречаются на противоположной стороне кольца, и репликация завершается. У эукариот на каждой хромосоме тысячи точек начала; на электронных микрофотографиях реплицирующейся ДНК видны многочисленные «глазки» — участки, где цепи уже удвоены (подробнее — в статье «Механизм репликации ДНК»).

13. Репликация в пробирке

В 1956–1958 годах американский биохимик Артур Корнберг выделил из кишечной палочки фермент, способный синтезировать ДНК в пробирке, — ДНК-полимеразу [13]. Для работы ей нужны были четыре вида дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, ионы магния и обязательно готовая ДНК — матрица. Без матрицы синтез не шёл. А состав синтезированной ДНК повторял состав матрицы: если в пробирку добавляли ДНК с высоким содержанием Г — Ц, новая ДНК тоже была богата Г — Ц. Так в пробирке подтвердилось, что синтез ДНК — матричный процесс. В 1959 году Корнберг получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Интересно, что этот первый найденный фермент оказался не главным участником репликации: у мутантных бактерий без него репликация шла. Основную работу выполняет другая полимераза, открытая позже, а фермент Корнберга участвует в заполнении промежутков и в репарации. История показывает, как опасно делать выводы о живой клетке только по опытам в пробирке.

14. Значение репликации и судьба хромосом

В S-периоде каждая хромосома, до того состоявшая из одной молекулы ДНК, получает вторую молекулу. Число хромосом не меняется, потому что обе копии остаются связанными в области центромеры: хромосома становится двухроматидной, а набор меняется с 2n2c на 2n4c (подробнее — в статье «Клеточный цикл и интерфаза»).

Биологическое значение репликации — точная передача наследственной информации. При митозе сестринские хроматиды расходятся, и обе дочерние клетки получают одинаковый полный набор генов. Без репликации каждое деление уменьшало бы количество ДНК вдвое. Сестринские хроматиды удерживаются вместе белковыми кольцами — когезинами — от S-периода до анафазы; именно разрушение когезинов в анафазе позволяет хроматидам разойтись.

Полуконсервативный способ дополнительно повышает надёжность. В каждой новой молекуле одна цепь материнская, «проверенная», а другая — только что синтезированная. Если между ними обнаруживается несоответствие, ферменты репарации исправляют именно новую цепь, ориентируясь на старую. У кишечной палочки старую цепь отличают по метильным группам, которые ферменты присоединяют к аденину в последовательностях ГАТЦ с некоторой задержкой после репликации. Пока новая цепь ещё не метилирована, система исправления «знает», какая из двух цепей новая.

15. Ошибки репликации и эволюция

Хотя репликация очень точна, ошибки всё же происходят, и именно они служат главным источником новых мутаций. Исландские генетики в 2012 году прочитали геномы 78 семей «родители — ребёнок» и подсчитали, сколько новых мутаций появляется у ребёнка, которых не было ни у одного из родителей [14]. В среднем — около 60 на геном, то есть примерно одна новая замена на 80 миллионов нуклеотидов за поколение.

Самое интересное — от кого они берутся. Большинство новых мутаций ребёнок получает от отца, и их число растёт с возрастом отца — примерно на две мутации за каждый год. Причина в репликации. Яйцеклетки женщины образуются ещё до её рождения, и после этого клетки-предшественники не делятся. А сперматогонии мужчины делятся всю жизнь: к 20 годам они проходят около 150 делений, к 40 годам — около 600. Каждое деление — это репликация ДНК и новый шанс для ошибки.

16. Репликация в цифрах

Масштаб работы, которую клетка выполняет в S-периоде, трудно представить. Диплоидная клетка человека содержит около 6,4 млрд пар нуклеотидов. Если вытянуть всю её ДНК в одну нить, получится около 2 м. Всё это нужно скопировать за 6–8 часов: синтезировать около 12,8 млрд новых нуклеотидов — в среднем больше 400 тысяч в секунду на клетку, — и почти без ошибок.

Частота ошибок 10⁻¹⁰ означает примерно одну ошибку на 10 млрд скопированных нуклеотидов. При удвоении генома человека это меньше одной новой мутации на деление (6,4·10⁹ · 10⁻¹⁰ ≈ 0,6). Для сравнения: если бы машинистка с такой точностью перепечатывала книги по тысяче страниц, она делала бы одну опечатку примерно на пять тысяч книг. Как достигается такая точность, разобрано в статье «Механизм репликации ДНК».

17. Репликация у вирусов и органоидов

Принципы комплементарности и матричного синтеза общие для всех живых систем, но конкретные способы удвоения генома разнообразны.

При репликации «катящимся кольцом» одна цепь кольцевой ДНК надрезается, и к её 3′-концу фермент присоединяет нуклеотиды, используя как матрицу вторую, целую цепь. Новая цепь растёт, а старая сматывается с кольца, как нитка с катушки. Так можно получить длинную цепь из многих копий генома подряд, которую затем разрезают на отдельные копии. Этим способом размножаются многие бактериофаги и плазмиды, а при конъюгации бактерий по нему одна цепь плазмиды переходит в клетку-реципиент (подробнее — в статье «Бактериофаги и ретровирусы»).

18. Репликация в пробирке: ПЦР

Знание принципов репликации позволило копировать ДНК вне клетки. В полимеразной цепной реакции (ПЦР), придуманной американским биохимиком Кэри Маллисом в 1983 году, используют те же принципы:

1. Денатурация. Пробу нагревают примерно до 95 °C, водородные связи разрываются, и цепи ДНК расходятся; в клетке ту же работу выполняет фермент хеликаза.
2. Отжиг праймеров. При охлаждении до 50–65 °C к матрице по принципу комплементарности присоединяются короткие затравки — праймеры, ограничивающие нужный участок.
3. Синтез. При 72 °C термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из бактерии горячих источников, достраивает новые цепи в направлении 5′ → 3′ от праймеров.

Каждый такой цикл удваивает число копий нужного участка. За 30 циклов из одной молекулы получается около миллиарда копий (2³⁰ ≈ 1,07·10⁹). ПЦР — пример того, как три принципа репликации — комплементарность, антипараллельность и использование каждой цепи как матрицы — стали основой одного из главных методов биологии и медицины (подробнее — в статье о синтезе гена и рекомбинантных ДНК). Маллис получил за это изобретение Нобелевскую премию по химии 1993 года — всего через десять лет после того, как придумал метод.

19. Как метят ДНК

Почти всё, что мы знаем о репликации, получено с помощью меток — способов отличить новую ДНК от старой.

Все эти вещества — аналоги нуклеотидов или содержат изотопы элементов, входящих в ДНК. Клетка встраивает их при репликации, «не замечая» подмены. Выбор метки определяет, что можно увидеть: плотность ДНК, место синтеза в клетке или в хромосоме, число делящихся клеток в ткани.

20. Итог: принципы репликации

• Репликация — матричный синтез ДНК: на каждой цепи исходной молекулы строится новая, комплементарная ей.
• Комплементарность: А — Т (две водородные связи), Г — Ц (три). Отсюда правило Чаргаффа: в двуцепочечной ДНК А = Т, Г = Ц.
• Антипараллельность: цепи ориентированы противоположно; новая цепь растёт только в направлении 5′ → 3′.
• Полуконсервативность: каждая дочерняя молекула содержит одну старую и одну новую цепь; это доказали Мезельсон и Сталь (1958), а для хромосом — Тейлор (1957).
• Сестринские хроматиды — две копии одной молекулы ДНК; они идентичны и расходятся в митозе.
• Значение репликации — точная передача наследственной информации дочерним клеткам.
• Строительный материал репликации — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты; энергию для образования связи даёт отщепление двух фосфатов входящего нуклеотида.
• Без 3′-гидроксильной группы цепь не может удлиняться: на этом основаны метод Сэнгера и противовирусные лекарства — «обрыватели цепи».

21. Частые ошибки

• «Полуконсервативный — значит, половина молекул старые, а половина новые». Нет: каждая молекула наполовину старая — одна цепь материнская, другая новая.
• «Правило Чаргаффа выполняется для одной цепи». Правило относится к двуцепочечной молекуле. В одной цепи А и Т обычно не равны.
• «А + Т = Г + Ц». Это неверно: равны А + Г и Т + Ц, а соотношение (А + Т) : (Г + Ц) у разных видов разное.
• «Между А и Т три водородные связи». Две; три — между Г и Ц.
• «Новая цепь параллельна матрице». Новая цепь антипараллельна матрице: напротив 3′-конца матрицы — 5′-конец новой цепи.
• «ДНК-полимераза может наращивать цепь в обе стороны». Только в направлении 5′ → 3′, присоединяя нуклеотиды к 3′-концу.
• «В опыте Мезельсона и Сталя после второго деления — одна промежуточная полоса». После второго деления две полосы равной интенсивности: промежуточная и лёгкая. Одна полоса — после первого деления.
• «Сестринские хроматиды — это гомологичные хромосомы». Сестринские хроматиды — копии одной молекулы ДНК, а гомологичные хромосомы — разные молекулы, полученные от разных родителей.
• «Комплементарные цепи одинаковы». Комплементарные цепи не одинаковы, а дополняют друг друга: напротив А стоит Т, напротив Г — Ц. Одинаковы две дочерние молекулы ДНК, образовавшиеся при репликации.
• «Репликация идёт в митозе». Репликация идёт в синтетическом периоде интерфазы; в митозе удвоенные хромосомы только распределяются между дочерними клетками.
• «Мезельсон и Сталь использовали радиоактивную метку». Изотоп ¹⁵N не радиоактивен; метку обнаруживали по плотности ДНК. Радиоактивную метку (тритий) использовал Тейлор.
• «При репликации в ДНК встраиваются рибонуклеотиды». В готовую ДНК встраиваются только дезоксирибонуклеотиды; короткие РНК-затравки потом удаляются.

22. Интересные факты

• Мэтью Мезельсону во время опыта было 27 лет, Франклину Сталю — 28. Они познакомились летом 1954 года в лаборатории в Вудс-Холе и тогда же договорились поставить опыт вместе.
• Тяжёлый изотоп азота ¹⁵N не радиоактивен — это просто атом азота с лишним нейтроном. Поэтому опыт был безопасен, а метку «видели» не по излучению, а по плотности.
• Рентгенограмма ДНК, известная как «фотография 51», была получена в лаборатории Розалинд Франклин в 1952 году. Уотсон увидел её без ведома Франклин, и она помогла ему понять, что ДНК — двойная спираль.
• Если бы ДНК одной клетки человека увеличить так, чтобы нить стала толщиной в швейную нитку, её длина составила бы около 200 км — больше, чем от Москвы до Твери.
• Фредерик Сэнгер стал первым человеком, получившим две Нобелевские премии по химии: за определение последовательности аминокислот инсулина (1958) и за метод чтения ДНК (1980).
• 19 марта 1953 года, ещё до публикации, Фрэнсис Крик написал двенадцатилетнему сыну письмо, где объяснил модель ДНК и нарисовал её. В 2013 году это письмо продали на аукционе более чем за 5 млн долларов.
• Мишер выделил первую ДНК из гноя, а позже — из спермы лососей, которых ловили в Рейне: головки сперматозоидов почти целиком состоят из ядра и были удобным источником нуклеина.
• Слова «комплементарный» и «комплимент» — родственники: оба восходят к латинскому complementum — «дополнение».
• Термостабильная ДНК-полимераза для ПЦР выделена из бактерии Thermus aquaticus, обитающей в горячих источниках Йеллоустонского парка при температуре около 70 °C.
• В 1967 году Корнберг с коллегами с помощью ДНК-полимеразы скопировал в пробирке ДНК фага φX174 так точно, что синтетическая молекула оказалась заразной: попав в бактерии, она вызывала размножение фага. Газеты тогда писали, что учёные «создали жизнь в пробирке».

23. Частые вопросы

24. ЕГЭ

Принципы репликации входят в элемент 2.6 кодификатора [15]. Их проверяют задания части 1 (свойства ДНК, расчёты по правилу Чаргаффа, установление последовательности событий опыта) и задачи линии 27 — на построение комплементарной цепи, подсчёт водородных связей, распределение метки после репликации.

Разбор задачи на комплементарную цепь

Фрагмент одной цепи ДНК имеет последовательность 5′-ГЦТАГГАТЦЦАТГ-3′. Определите последовательность второй цепи, число водородных связей между цепями и процентное содержание адениловых нуклеотидов во фрагменте двуцепочечной ДНК. Объясните.

Решение.

1. По принципу комплементарности (А — Т, Г — Ц) и антипараллельности вторая цепь: 3′-ЦГАТЦЦТАГГТАЦ-5′.
2. В первой цепи А — 3, Т — 3, Г — 4, Ц — 3. В двуцепочечном фрагменте пар А — Т 6, пар Г — Ц 7. Водородных связей: 6 · 2 + 7 · 3 = 33.
3. Всего нуклеотидов 26; адениловых — 6 (3 в первой цепи и 3 во второй, напротив тимина). 6 / 26 ≈ 23,1 %.

Задача на состав по одной цепи

В одной цепи ДНК адениловых нуклеотидов 20 %, тимидиловых 30 %, гуаниловых 35 %, цитидиловых 15 %. Определите состав второй цепи и всей двуцепочечной молекулы.

Решение. Вторая цепь комплементарна первой: в ней Т = 20 % (напротив А), А = 30 % (напротив Т), Ц = 35 % (напротив Г), Г = 15 % (напротив Ц). В двуцепочечной молекуле нуклеотидов вдвое больше, и доля каждого — среднее по двум цепям: А = (20 + 30) / 2 = 25 %, Т = 25 %, Г = (35 + 15) / 2 = 25 %, Ц = 25 %. Обратите внимание: в одной цепи А ≠ Т, а во всей молекуле А = Т, как требует правило Чаргаффа.

Задача на распределение метки

Клетку, все молекулы ДНК которой содержат только тяжёлый изотоп азота, перенесли на среду с лёгким изотопом. Сколько молекул ДНК, произошедших от одной исходной молекулы, будут содержать тяжёлый изотоп после трёх репликаций? Какая доля всех молекул это составит?

Решение. Репликация полуконсервативная: каждая из двух тяжёлых цепей исходной молекулы сохраняется и при каждой репликации переходит в одну из дочерних молекул. После трёх репликаций из одной молекулы образуется 2³ = 8 молекул; тяжёлые цепи есть только в двух из них (гибридные молекулы). Доля — 2/8 = ¼.

Как формулировать ответ

В задачах на репликацию проверяют не только последовательность, но и обоснование. Хорошие формулировки: «по принципу комплементарности напротив А встаёт Т, напротив Г — Ц»; «цепи ДНК антипараллельны, поэтому 5′-концу матрицы соответствует 3′-конец новой цепи»; «репликация полуконсервативная: каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую и одну новую цепь». Слова «удваивается хромосома» вместо «реплицируется ДНК» и отсутствие концов 5′ и 3′ — типичные причины потери баллов.

Что обязательно знать к экзамену

• Три принципа репликации и их смысл.
• Правило Чаргаффа и умение по проценту одного нуклеотида найти остальные.
• Число водородных связей в парах А — Т и Г — Ц.
• Направление синтеза новой цепи (5′ → 3′) и запись комплементарной цепи с концами.
• Опыт Мезельсона и Сталя: схема, результаты после первого и второго делений, вывод.
• Когда и где идёт репликация у эукариот и прокариот.

25. Для олимпиад

Состав ДНК и температура плавления

При нагревании двуцепочечная ДНК «плавится» — цепи расходятся. Плавление легко заметить по поглощению ультрафиолета: одиночные цепи поглощают свет с длиной волны 260 нм примерно на 40 % сильнее, чем двойная спираль. Температура, при которой разошлась половина молекул, называется температурой плавления (Tₘ). В стандартном солевом растворе для длинных молекул ДНК она примерно описывается эмпирической формулой Tₘ ≈ 69,3 + 0,41 · (Г + Ц, %) °C. ДНК с 40 % пар Г — Ц плавится примерно при 86 °C, а с 60 % — примерно при 94 °C. При охлаждении комплементарные цепи снова находят друг друга — на этом основаны ПЦР и метод гибридизации нуклеиновых кислот.

Второе правило Чаргаффа

Первое правило Чаргаффа (А = Т, Г = Ц в двуцепочечной ДНК) следует из спаривания. Но в 1968 году Чаргафф с сотрудниками разделили цепи ДНК бактерии и обнаружили неожиданное: и внутри одной цепи количество А почти равно количеству Т, а Г — количеству Ц. Это так называемое второе правило Чаргаффа выполняется для длинных участков почти всех геномов. Оно не вытекает из комплементарности и до сих пор объясняется предположительно — например, тем, что за миллионы лет гены и другие участки много раз «переворачивались» внутри хромосом, и обе цепи стали статистически похожи. Для коротких фрагментов из задач ЕГЭ второе правило, разумеется, не выполняется.

Топологическая проблема Дельбрюка

Две цепи двойной спирали перекручены одна вокруг другой, как две пряди верёвки. Число таких перекрутов для замкнутой молекулы (кольцевой ДНК) не может измениться без разрыва цепи. Значит, при репликации кольцевой хромосомы бактерии топоизомеразы должны разрезать и сшивать цепи сотни тысяч раз. А после окончания репликации две дочерние кольцевые молекулы оказываются продетыми одна в другую, как звенья цепи, и разделить их может только фермент, разрезающий сразу обе цепи одной молекулы и пропускающий через разрыв другую. Именно на этих ферментах — бактериальной ДНК-гиразе и топоизомеразе IV — основано действие антибиотиков фторхинолонов.

Кривые плотности в опыте Мезельсона и Сталя

В опыте с бактериями, растущими экспоненциально, пробы берут не точно в момент деления, а через промежутки, соответствующие поколениям. Поэтому, например, через 1,5 поколения в пробе есть и гибридная, и лёгкая ДНК, а их соотношение зависит от доли клеток, успевших реплицировать хромосому повторно. Если популяцию перенести на тяжёлую среду обратно, через одно поколение лёгкая ДНК превратится в гибридную, а гибридная частично — в тяжёлую. Такие «обратные» опыты дают задачи олимпиадного уровня на подсчёт долей полос.

Плотности полос

В градиенте хлорида цезия лёгкая ДНК кишечной палочки (¹⁴N) имеет плотность около 1,710 г/см³, а тяжёлая (¹⁵N) — около 1,724 г/см³. Гибридная молекула, в которой одна цепь тяжёлая, а другая лёгкая, должна иметь плотность ровно посередине — около 1,717 г/см³. Именно там и оказалась полоса после первого деления. Совпадение с расчётом — ещё один довод в пользу того, что гибридная молекула содержит ровно половину тяжёлого азота.

Как отличить полуконсервативную гипотезу от дисперсной уже после первого деления

После первого деления обе гипотезы предсказывают одну промежуточную полосу. Различить их можно, если разделить цепи гибридной ДНК нагреванием и снова центрифугировать. При полуконсервативной репликации получатся две полосы одиночных цепей — тяжёлая и лёгкая. При дисперсной — одна полоса промежуточной плотности, потому что каждая цепь наполовину тяжёлая, наполовину лёгкая. Опыт с нагреванием дал две полосы, что согласуется только с полуконсервативной моделью.

Репликационные «фабрики»

Если клеткам в S-периоде дать на несколько минут аналог тимидина и затем окрасить его, в ядре видна не равномерная окраска, а сотни отдельных светящихся точек. Каждая точка — скопление из многих одновременно работающих вилок с их ферментами. Картина точек меняется по ходу S-периода: в начале они мелкие и разбросаны по всему ядру (реплицируется эухроматин), в конце — крупные и лежат у ядерной оболочки и вокруг ядрышка (реплицируется гетерохроматин). По такой картине можно определить, на каком этапе S-периода находится клетка.

Почему в ДНК тимин, а не урацил

Цитозин в ДНК иногда самопроизвольно теряет аминогруппу и превращается в урацил — это одно из самых частых повреждений ДНК. Если бы урацил был нормальным основанием ДНК, ферменты репарации не могли бы отличить «законный» урацил от урацила, возникшего из цитозина. Поскольку в ДНК вместо урацила используется тимин (урацил с метильной группой), любой урацил в ДНК — признак повреждения, и особый фермент его вырезает. Это одно из объяснений того, почему в ДНК тимин, а в РНК, которая живёт недолго и не хранит информацию поколениями, — урацил.

26. Задания с разбором

Задание 1

Выберите три верных ответа. Репликация ДНК происходит по принципам: 1) комплементарности; 2) антипараллельности; 3) полуконсервативности; 4) консервативности; 5) дисперсности; 6) вырожденности.

Задание 2

В молекуле ДНК на долю гуаниловых нуклеотидов приходится 26 %. Определите процентное содержание тимидиловых нуклеотидов.

Задание 3

Установите последовательность этапов опыта Мезельсона и Сталя: А) перенос бактерий на среду с ¹⁴N; Б) выращивание бактерий на среде с ¹⁵N в течение многих поколений; В) выделение ДНК из проб; Г) центрифугирование ДНК в градиенте плотности хлорида цезия; Д) отбор проб через одно и два поколения; Е) сравнение положения полос с предсказаниями гипотез.

Задание 4

Найдите ошибки в тексте. (1) Цепи ДНК антипараллельны. (2) Между аденином и тимином образуются три водородные связи. (3) По правилу Чаргаффа в ДНК А + Т = Г + Ц. (4) ДНК-полимераза наращивает цепь в направлении 5′ → 3′. (5) Репликация ДНК происходит в синтетическом периоде интерфазы.

Задание 5

Установите соответствие между результатами опыта и гипотезами репликации, которые они опровергают. Результаты: А) после первого деления нет тяжёлой полосы; Б) после второго деления две полосы, а не одна; В) после второго деления есть промежуточная полоса. Гипотезы: 1) консервативная; 2) дисперсная.

Задание 6

Фрагмент одной цепи ДНК: 5′-ТТАГЦЦГАТАЦГ-3′. Определите последовательность второй цепи и число водородных связей между цепями во фрагменте.

Задание 7

Выберите три верных ответа. В двуцепочечной ДНК всегда выполняются равенства: 1) А = Т; 2) Г = Ц; 3) А + Г = Т + Ц; 4) А = Г; 5) А + Т = Г + Ц; 6) Т = Ц.

Задание 8

Фрагмент двуцепочечной ДНК содержит 2000 нуклеотидов, из них 560 адениловых. Определите число тимидиловых, гуаниловых и цитидиловых нуклеотидов, число водородных связей и длину фрагмента, если расстояние между соседними парами нуклеотидов — 0,34 нм.

Задание 9

Почему в ДНК бактериофага φX174 количество аденина не равно количеству тимина?

Задание 10

Бактерию, вся ДНК которой содержала ¹⁵N, перенесли на среду с ¹⁴N. Какая доля молекул ДНК будет гибридной (¹⁵N/¹⁴N) после четырёх репликаций? Объясните.

Задание 11

Почему ДНК-полимераза не может начать синтез цепи без затравки, но может продолжить её? Как это связано с направлением синтеза?

Задание 12

Установите соответствие между свойствами и молекулами. Свойства: А) копии одной молекулы ДНК; Б) одна получена от отца, другая от матери; В) расходятся в анафазе митоза; Г) могут нести разные аллели одного гена; Д) образуются в синтетическом периоде. Молекулы: 1) сестринские хроматиды; 2) гомологичные хромосомы.

Задание 13

Корешки растения выращивали на среде с меченым тимидином в течение одной репликации, а затем перенесли на среду без метки и дали пройти ещё одну репликацию. Сколько хроматид в каждой хромосоме будут мечеными в метафазе после второй репликации? Объясните.

Задание 14

Объясните, какое значение для точности репликации имеет полуконсервативный способ.

Задание 15

Выберите три верных ответа. В опыте Мезельсона и Сталя: 1) использовали тяжёлый изотоп азота; 2) ДНК разделяли центрифугированием в градиенте плотности; 3) после первого деления на лёгкой среде получили одну промежуточную полосу; 4) использовали радиоактивную метку; 5) работали с клетками конского боба; 6) после второго деления получили одну промежуточную полосу.

Задание 16

Какие свойства ДНК обеспечивают возможность её точного удвоения? Назовите три.

Задание 17

В ДНК одного вида бактерий пар Г — Ц 70 %, другого — 35 %. ДНК какой бактерии разделяется на цепи при более высокой температуре? Объясните.

Задание 18

Почему в состав ДНК входит тимин, а не урацил, хотя они различаются лишь метильной группой?

Задание 19 (олимпиадное)

Культуру бактерий, выращенную на ¹⁵N, перенесли на среду с ¹⁴N и дали пройти два поколения, а затем вернули на среду с ¹⁵N и дали пройти ещё одно поколение. Какие полосы и в каком соотношении будут видны при центрифугировании ДНК? Объясните.

Задание 20 (олимпиадное)

Две кольцевые молекулы ДНК после окончания репликации бактериальной хромосомы оказываются сцепленными, как звенья цепи. Почему это неизбежно и какой фермент необходим для их разделения? Почему ингибиторы этого фермента подавляют рост бактерий?

Литература

1. Watson J. D., Crick F. H. C. Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid // Nature. 1953. Vol. 171. P. 737–738.
2. Watson J. D., Crick F. H. C. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid // Nature. 1953. Vol. 171. P. 964–967.
3. Avery O. T., MacLeod C. M., McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types // Journal of Experimental Medicine. 1944. Vol. 79. P. 137–158.
4. Hershey A. D., Chase M. Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage // Journal of General Physiology. 1952. Vol. 36. P. 39–56.
5. Chargaff E. Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymatic degradation // Experientia. 1950. Vol. 6. P. 201–209.
6. Franklin R. E., Gosling R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate // Nature. 1953. Vol. 171. P. 740–741.
7. Pauling L., Corey R. B. A proposed structure for the nucleic acids // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1953. Vol. 39. P. 84–97.
8. Sinsheimer R. L. A single-stranded deoxyribonucleic acid from bacteriophage φX174 // Journal of Molecular Biology. 1959. Vol. 1. P. 43–53.
9. Meselson M., Stahl F. W. The replication of DNA in Escherichia coli // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1958. Vol. 44. P. 671–682.
10. Taylor J. H., Woods P. S., Hughes W. L. The organization and duplication of chromosomes as revealed by autoradiographic studies using tritium-labeled thymidine // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1957. Vol. 43. P. 122–128.
11. Latt S. A. Microfluorometric detection of deoxyribonucleic acid replication in human metaphase chromosomes // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1973. Vol. 70. P. 3395–3399.
12. Cairns J. The bacterial chromosome and its manner of replication as seen by autoradiography // Journal of Molecular Biology. 1963. Vol. 6. P. 208–213.
13. Lehman I. R., Bessman M. J., Simms E. S., Kornberg A. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli // Journal of Biological Chemistry. 1958. Vol. 233. P. 163–170.
14. Kong A., Frigge M. L., Masson G. et al. Rate of de novo mutations and the importance of father’s age to disease risk // Nature. 2012. Vol. 488. P. 471–475.
15. ФИПИ. Кодификатор проверяемых требований к результатам освоения основной образовательной программы и элементов содержания для проведения ЕГЭ по биологии, 2027 г. М.: ФИПИ, 2026.