TOC и TIC: как белки попадают в хлоропласт

В школьном учебнике хлоропласт называют полуавтономным органоидом: у него есть своя кольцевая ДНК и свои рибосомы, и часть белков он синтезирует сам. Но эта часть мала. В пластиде наземного растения закодировано около 80 белков, а работает в ней 2–3 тысячи. Все остальные белки — больше 95 % — закодированы в ядре, синтезируются в цитоплазме и должны пройти внутрь хлоропласта через две мембраны его оболочки. Эту работу выполняют два белковых комплекса — TOC (translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts) и TIC (translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts), то есть транслоконы наружной и внутренней мембраны оболочки хлоропласта.

В статье — зачем хлоропласту ввозить белки и как белок «узнаёт» дорогу, из чего состоят TOC и TIC и что тянет белок внутрь, куда белок попадает после этого, как клетка регулирует импорт, чем система хлоропласта отличается от митохондриальной и откуда она взялась. Отдельно — что пересмотрели в 2013–2024 годах, когда удалось увидеть транслоконы с атомным разрешением, что из этого нужно на ЕГЭ и что — на олимпиаде. В конце — 12 заданий с разбором.

• Зачем хлоропласту ввозить белки
• Как открыли импорт белков
• Транзитный пептид: адрес на белке
• Устройство оболочки и транслоконов
• TOC: ворота наружной мембраны
• TIC: ворота внутренней мембраны
• Мотор: что тянет белок внутрь
• Что происходит с белком дальше
• Регуляция импорта
• Сравнение с митохондриями
• Происхождение системы импорта
• Что нужно на ЕГЭ
• Для олимпиад
• Задания с разбором
• Литература

Зачем хлоропласту ввозить белки

Хлоропласт произошёл от цианобактерии, которую более полутора миллиардов лет назад поглотил предок архепластид — глаукофитов, красных водорослей и зелёных растений (подробнее — в статьях «Эндосимбиоз и симбиогенез» и «Архепластиды»). У свободноживущей цианобактерии 3–7 тысяч генов. В пластиде наземного растения их осталось около 120–130, из них белки кодируют примерно 80; остальные гены пластиды — это гены рибосомных и транспортных РНК.

Куда делись гены цианобактерии? Многие оказались не нужны в клетке хозяина и исчезли, а сотни других перешли в ядро. Такой процесс называют эндосимбиотическим переносом генов: фрагменты ДНК пластиды попадали в ядро (это происходит и сейчас — в лабораторных опытах на табаке примерно в одной из 16 тысяч пыльцевых клеток), и если перенесённый ген приобретал ядерный промотор и сигнал доставки белка обратно в пластиду, его копию в пластиде можно было потерять. Сравнение геномов показывает, что около 18 % генов ядра арабидопсиса получены от цианобактериального предка пластиды.

Самый известный пример — фермент рубиско, связывающий углекислый газ в цикле Кальвина. Он состоит из восьми больших и восьми малых субъединиц. Большая субъединица закодирована в пластиде (ген rbcL) и синтезируется на её рибосомах. Малая закодирована в ядре (ген RbcS), синтезируется в цитоплазме и ввозится в хлоропласт. Фермент собирается в строме. Поэтому даже для одного фермента нужна согласованная работа двух геномов и система импорта.

Почему у пластиды вообще остались собственные гены, если почти всё перешло в ядро? Одно из объяснений: это гены крупных, сильно гидрофобных белков, встроенных в мембраны тилакоидов (например, белков фотосистем), которые трудно провести через две мембраны, и гены, экспрессию которых пластида должна быстро регулировать сама, отвечая на изменения работы электрон-транспортной цепи.

Как открыли импорт белков

В 1978 году две группы — Нам-Хай Чуа и Грегори Шмидт в Рокфеллеровском университете и Питер Хайфилд и Джон Эллис в Уорикском университете — синтезировали малую субъединицу рубиско в пробирке на матричной РНК растения. Оказалось, что синтезируется белок на несколько килодальтон крупнее зрелой субъединицы. Если добавить к нему изолированные хлоропласты, этот предшественник проникает внутрь, лишний участок отрезается, и белок встраивается в фермент. Так было доказано, что белки ввозятся в хлоропласт после синтеза, а адрес записан в самом белке.

Транзитный пептид: адрес на белке

Белок, предназначенный для хлоропласта, синтезируется в виде предшественника (препротеина). На его N-конце — дополнительный участок, транзитный пептид, длиной обычно 30–80 аминокислот (иногда больше ста). Это «адресная наклейка»: если транзитный пептид присоединить методами генной инженерии к постороннему белку, например к зелёному флуоресцентному белку медузы, этот белок окажется в хлоропластах.

У транзитных пептидов нет общей последовательности — они различаются у разных белков. Их объединяет состав:

• много остатков серина и треонина (гидроксилированных аминокислот);
• почти нет кислых остатков (аспарагиновой и глутаминовой кислот), поэтому суммарный заряд положительный;
• в растворе транзитный пептид не образует устойчивой спирали — это гибкая неупорядоченная цепь, которая принимает форму только при связывании с рецепторами и липидами мембраны.

Внутри хлоропласта стромальная пептидаза отрезает транзитный пептид, и он быстро разрушается. Поэтому зрелый белок короче предшественника, и по этой разнице на электрофорезе легко отличить белок, уже вошедший в хлоропласт, от белка, который только прилип к его поверхности.

Устройство оболочки и транслоконов

Оболочка хлоропласта состоит из двух мембран. Наружная мембрана — потомок наружной мембраны цианобактерии, хотя многие её липиды и белки добавила клетка-хозяин. Внутренняя мембрана — потомок плазматической мембраны цианобактерии. Между ними — узкое межмембранное пространство, а внутри — строма с тилакоидами. На рисунке показан белок в момент импорта.

Названия белков образованы по общему правилу, принятому в 1997 году: Toc или Tic и молекулярная масса в килодальтонах. Toc75 — белок транслокона наружной мембраны массой 75 кДа, Tic20 — белок транслокона внутренней мембраны массой 20 кДа. Исключения — белки, закодированные в самой пластиде: их называли по номеру открытой рамки считывания (ycf — hypothetical chloroplast open reading frame). Tic214 — это продукт гена ycf1, а Ycf2 сохранил старое название.

Весь путь белка показан на схеме ниже. Важно, что транслоконы двух мембран не работают поодиночке: в местах, где мембраны сближаются, TOC и TIC образуют единый суперкомплекс, и цепь проходит через обе мембраны непрерывно.

TOC: ворота наружной мембраны

Комплекс TOC состоит из трёх главных частей.

• Toc159 — рецептор, выступающий в цитоплазму. Он узнаёт транзитный пептид и расщепляет ГТФ. У арабидопсиса четыре белка этого семейства: Toc159 ввозит в основном белки фотосинтеза, а Toc132 и Toc120 — «хозяйственные» белки, которые нужны пластидам всех тканей, в том числе корней.
• Toc34 (у арабидопсиса — Toc33 и Toc34) — второй рецептор-ГТФаза. Вместе с Toc159 он связывает предшественник и, по-видимому, проверяет, подходит ли адрес.
• Toc75 — канал. Это белок-бочонок из β-тяжей, родственник бактериальных белков Omp85, которые у бактерий встраивают белки в наружную мембрану. Со стороны межмембранного пространства у него три домена POTRA, которые, вероятно, связывают проходящую цепь.

Структуры, полученные в 2022–2023 годах у хламидомонады, уточнили устройство канала. Оказалось, что бочонок образован не одним Toc75: с ним вместе собирается мембранная часть белка семейства Toc159, и получается гибридный канал. Toc34 и Toc159 расположены у его входа.

Для этапа узнавания и прочного связывания нужны ГТФ и небольшое количество АТФ (около 0,1 ммоль/л). Предшественник с отрезанным или испорченным транзитным пептидом не связывается.

TIC: ворота внутренней мембраны

С комплексом TIC связана одна из самых долгих дискуссий в биологии растений. В 1990-е годы главным белком TIC считали Tic110 — обильный белок внутренней мембраны, без которого зародыш арабидопсиса погибает. Предполагали, что он образует канал, а вместе с белком Tic40 и шапероном стромы Hsp93 — мотор, протягивающий белок.

В 2013 году японские исследователи из группы Масато Накаи (Университет Осаки) выделили из хлоропластов комплекс внутренней мембраны массой около 1 МДа, который связан с проходящим белком. В него входят Tic20, Tic56, Tic100 и Tic214, а Tic110 в нём нет. Tic20 — небольшой белок с четырьмя трансмембранными спиралями, мутанты без него — альбиносы. Tic214 — огромный белок примерно из 1800 аминокислот, закодированный в пластиде (ген ycf1). Это один из немногих генов пластиды, без которых растение не может жить.

Структуры 2022–2023 годов подтвердили новую модель. Путь цепи через внутреннюю мембрану образуют трансмембранные спирали Tic20 и Tic214 вместе с несколькими мелкими белками. Длинный участок Tic214 проходит через межмембранное пространство и прикрепляется к комплексу TOC — он и соединяет оба транслокона в суперкомплекс. В межмембранном пространстве работает также шаперон Tic22, который, вероятно, удерживает цепь от сворачивания.

Мотор: что тянет белок внутрь

Белок проходит через каналы в развёрнутом виде, и его нужно протянуть. Для этого нужна энергия АТФ в строме: в опытах импорт идёт только при концентрации АТФ около 1 ммоль/л и выше.

Старая модель: цепь тянут шапероны стромы — Hsp93 (родственник бактериального ClpC) и Hsp70, — прикреплённые к Tic110 и Tic40. Новая модель предложена той же японской группой в 2018 году: мотором служит комплекс Ycf2–FtsHi массой около 2 МДа. Ycf2 — ещё один гигантский белок (около 2300 аминокислот), закодированный в пластиде. FtsHi — белки, похожие на бактериальную протеазу FtsH, но потерявшие способность расщеплять белки. Вместе они образуют кольцо из шести АТФаз семейства AAA+, которое прикреплено к внутренней мембране и связано с TIC.

В 2024 году исследователи из Университета Вестлейк (Китай) опубликовали структуры этого мотора у арабидопсиса и хламидомонады и «застигла» в нём проходящий белок у гороха. Кольцо из шести субъединиц наклонено к мембране и, по-видимому, принимает цепь прямо из канала TIC. Предшественник усиливает расщепление АТФ мотором — так и должен вести себя мотор. Шапероны Hsp70 и Hsp93, вероятно, помогают ему, но не являются главной движущей силой.

Что происходит с белком дальше

После того как транзитный пептид отрезан, белок либо остаётся в строме и сворачивается с помощью шаперонинов Cpn60 и шаперонов Hsp70, либо отправляется дальше. Белкам тилакоидов нужен второй сигнал: например, пластоцианин, переносящий электроны в просвете тилакоида, имеет «двухчастный» адрес — транзитный пептид, а за ним сигнал для мембраны тилакоида. Этот второй сигнал отрезает уже другая пептидаза — в просвете тилакоида.

Пути в тилакоиды — тоже наследство цианобактерии. Путь Sec и путь Tat есть у бактерий: там они выводят белки через плазматическую мембрану. Путь Tat («twin-arginine translocation», транслокация по двум аргининам) уникален тем, что переносит через мембрану уже свёрнутые белки и использует энергию градиента протонов, который создаёт фотосинтез. Белки внутренней мембраны оболочки встраиваются двумя способами: либо останавливаются в канале TIC, либо сначала проходят в строму, а затем встраиваются из стромы.

Регуляция импорта

Пластиды разных тканей ввозят разные белки: этиопласт проростка в темноте, хлоропласт листа, хромопласт плода, амилопласт клубня (о типах пластид — в статье «Лейкопласты и другие бесцветные пластиды»). Клетка регулирует импорт несколькими способами.

• Набор рецепторов. В зелёных тканях много Toc159, ввозящего белки фотосинтеза; в корнях — Toc132 и Toc120.
• Замена транслоконов. В 2012 году в группе Пола Джарвиса (Оксфорд) нашли белок SP1 — убиквитинлигазу наружной мембраны. Она метит ненужные рецепторы TOC убиквитином, и в 2019 году та же группа описала, как помеченные белки вытаскиваются из мембраны (при участии белков SP2 и Cdc48) и разрушаются протеасомой. Этот механизм назвали CHLORAD. Он нужен, когда пластида меняет тип: например, когда проросток выходит на свет и этиопласт превращается в хлоропласт, или когда созревает плод.
• Окислительно-восстановительный контроль. Белки Tic62, Tic55 и Tic32, связанные с TIC, чувствительны к соотношению НАДФ⁺/НАДФН в строме и, вероятно, подстраивают импорт под работу фотосинтеза.
• Качество белка. Предшественники, застрявшие в канале, удаляются протеазами; если импорт нарушен, хлоропласт подаёт сигнал в ядро, и синтез белков для пластид снижается.

Сравнение с митохондриями

Митохондрии тоже ввозят большинство своих белков (у человека их около 1100–1500, а в митохондриальной ДНК закодировано только 13). Их транслоконы называются TOM и TIM (translocase of the outer/inner membrane). Задачи одинаковы, но устроены системы по-разному: они возникли независимо — это пример конвергентной эволюции.

Почему хлоропласт не использует мембранный потенциал? Возможное объяснение: заряд на внутренней мембране оболочки хлоропласта мал: основная разность зарядов и протонов создаётся на мембранах тилакоидов. Кроме того, на свету условия в строме резко меняются, а импорт должен идти и днём, и ночью.

Происхождение системы импорта

Система импорта собрана из деталей разного происхождения. Часть белков досталась от цианобактерии, где их родственники выполняли другие задачи; часть возникла в клетке-хозяине.

Отсюда два важных вывода. Первый: каналу Toc75 «пришлось» поменять направление работы — у бактерий белки семейства Omp85 встраивают в наружную мембрану белки, пришедшие изнутри клетки, а в хлоропласте Toc75 пропускает белки снаружи внутрь. Второй: одинаковые транслоконы TOC и TIC есть у глаукофитов, красных водорослей и зелёных растений. Сложная система из многих белков вряд ли возникла бы трижды одинаково, поэтому её общность — один из главных доводов в пользу того, что первичный эндосимбиоз у архепластид произошёл один раз.

Как возник транзитный пептид? Одна из гипотез: исходно это были антимикробные пептиды хозяина, которые связываются с мембранами бактерий; симбионт мог «приручить» их для ввоза белков. По другой гипотезе, транзитные пептиды возникали постепенно из случайных последовательностей, обогащённых серином, — такие последовательности уже немного направляют белок в пластиду.

Интересно сравнить с независимыми случаями. Амёба паулинелла получила свой органоид-хроматофор от другой цианобактерии около ста миллионов лет назад (см. статью «Паулинелла»). В её хроматофор ввозится более 200 белков ядра, и у крупных из них есть собственный, совсем непохожий сигнал длиной около 200 аминокислот. Это «молодая» система импорта, возникшая независимо.

У водорослей со вторичными пластидами (диатомей, бурых водорослей, криптофит, споровиков) белку нужно пройти через три или четыре мембраны. Их белки имеют двухчастный сигнал: сначала сигнальный пептид, который направляет белок в эндоплазматическую сеть, а за ним — транзитный пептид. Через вторую снаружи мембрану белок переносит система SELMA, «перепрофилированная» система эндоплазматической сети поглощённой водоросли, а через две внутренние мембраны — потомки тех же TOC и TIC. Так устроен, например, импорт в апикопласт малярийного плазмодия (см. статью «Малярийный плазмодий»).

Что нужно на ЕГЭ

Названий TOC и TIC на ЕГЭ не требуется. Но знание того, как белки попадают в хлоропласт, помогает правильно отвечать на вопросы о полуавтономности органоидов и о доказательствах симбиогенеза. Повторить строение органоидов можно в тренажёре по теме «Строение клетки».

Как использовать эти знания в развёрнутом ответе на вопрос «почему хлоропласт называют полуавтономным органоидом»: 1) у него своя кольцевая ДНК и рибосомы 70S, он синтезирует часть белков; 2) он размножается делением; 3) но большая часть его белков закодирована в ядре, синтезируется в цитоплазме и ввозится в хлоропласт, поэтому вне клетки он существовать не может.

Для олимпиад

Классический опыт с изолированными хлоропластами

Импорт изучают так: предшественник синтезируют в пробирке с радиоактивной меткой и добавляют к изолированным хлоропластам гороха. Затем часть хлоропластов обрабатывают протеазой (например, термолизином), которая не проникает через мембраны и разрушает только белки на поверхности. После этого белки разделяют электрофорезом. Результаты читают так:

• полоса предшественника, исчезающая после протеазы, — белок связан с поверхностью, но не вошёл внутрь;
• полоса зрелого белка (короче на длину транзитного пептида), сохраняющаяся после протеазы, — белок внутри;
• при низкой концентрации АТФ (около 0,1 ммоль/л) предшественник прочно связывается, но не входит — это «ранний промежуточный продукт импорта»; при 1–3 ммоль/л АТФ импорт завершается.

Разобщители и ионофоры, снимающие мембранный потенциал, импорт в хлоропласт в темноте не останавливают, а импорт в митохондрии — останавливают. Это один из способов показать различие двух систем.

Мутанты

Масштаб работы

Предшественник малой субъединицы рубиско входит в изолированный хлоропласт за минуты. Лист постоянно обновляет белки, особенно белки фотосистем, которые повреждаются светом, поэтому импорт идёт всю жизнь клетки, а не только при росте хлоропласта. Транзитный пептид после отщепления сразу разрушается: на его синтез клетка тратит заметную долю аминокислот, которые потом приходится перерабатывать.

Задания с разбором

Сначала ответьте сами, затем откройте разбор. Задания 11 и 12 — олимпиадные.

Задание 1

Выберите три верных утверждения о белках хлоропласта.

1. большинство белков хлоропласта закодировано в ядре
2. все белки хлоропласта синтезируются на его рибосомах
3. транзитный пептид находится на N-конце белка-предшественника
4. транзитный пептид остаётся в составе зрелого белка
5. для импорта белков в хлоропласт нужна энергия ГТФ и АТФ
6. белки проходят через оболочку хлоропласта в полностью свёрнутом виде

Задание 2

Установите последовательность событий при импорте белка в строму хлоропласта.

1. отщепление транзитного пептида
2. синтез предшественника на рибосомах цитоплазмы
3. связывание транзитного пептида рецепторами наружной мембраны
4. прохождение цепи через канал наружной мембраны
5. сворачивание белка при участии шаперонинов
6. протягивание цепи через внутреннюю мембрану мотором, расщепляющим АТФ

Задание 3

Установите соответствие между признаком системы импорта и органоидом: А — хлоропласт, Б — митохондрия.

1. канал наружной мембраны — родственник бактериальных белков Omp85
2. сигнал — амфипатическая α-спираль с положительным зарядом
3. перенос через внутреннюю мембрану требует мембранного потенциала
4. рецепторы наружной мембраны — ГТФазы
5. часть белков, попав внутрь, отправляется дальше в тилакоиды
6. два компонента системы импорта закодированы в ДНК самого органоида

Задание 4

Большая субъединица фермента рубиско синтезируется в хлоропласте, а малая — в цитоплазме. Объясните, как малая субъединица оказывается в составе фермента в строме и почему ген этой субъединицы находится в ядре.

Задание 5

Исследователь получил два трансгенных растения табака. У первого в ядро встроен ген зелёного флуоресцентного белка (GFP), у второго — тот же ген, к началу которого присоединён участок, кодирующий транзитный пептид малой субъединицы рубиско. Где будет видна флуоресценция в клетках каждого растения? Что в этом опыте служит контролем? Какой вывод можно сделать?

Задание 6

Мутант арабидопсиса без белка Toc159 — альбинос, но на среде с сахарозой он растёт и его пластиды сохраняются. Объясните эти факты.

Задание 7

Белок пластоцианин работает в просвете тилакоида. Его предшественник имеет два сигнала, расположенных один за другим на N-конце. Объясните, зачем нужны два сигнала и что с ними происходит.

Задание 8

Почему одинаковое устройство системы импорта белков у глаукофитов, красных водорослей и зелёных растений считают доводом в пользу того, что первичный эндосимбиоз у них произошёл один раз? Почему рецепторы TOC должны были возникнуть в клетке-хозяине, а канал Toc75 мог достаться от цианобактерии?

Задание 9

Белки, которые работают в апикопласте малярийного плазмодия (бывшем хлоропласте красной водоросли, окружённом четырьмя мембранами), имеют на N-конце двухчастный сигнал: сигнальный пептид, а за ним транзитный пептид. Объясните, зачем нужны обе части.

Задание 10

В пластидах злаков нет генов ycf1 и ycf2, кодирующих белки канала (Tic214) и мотора (Ycf2) у большинства растений. Какие выводы можно сделать из этого факта? Почему его считают важным для спора о том, как устроены TIC и мотор импорта?

Задание 11 (олимпиадное)

Радиоактивный предшественник малой субъединицы рубиско (20 кДа; зрелая субъединица — 14 кДа) добавили к изолированным хлоропластам гороха в темноте при разных условиях. Затем половину каждой пробы обработали термолизином — протеазой, не проникающей через мембраны. Хлоропласты отмыли и провели электрофорез.

Объясните результаты каждой пробы. Почему зрелый белок легче предшественника? Какой вывод можно сделать из пробы 4, если известно, что валиномицин снимает мембранный потенциал?

Задание 12 (олимпиадное)

В хлоропласте растения работает около 2500 разных белков, а в ДНК пластиды закодировано около 80. 1) Какая доля белков хлоропласта (в процентах) закодирована в ядре? 2) Средняя длина зрелого белка хлоропласта — около 400 аминокислот, транзитного пептида — около 60. Какую долю аминокислот, включённых в предшественники, клетка тратит на транзитные пептиды? 3) Почему, несмотря на эти затраты, гены продолжали переходить из пластиды в ядро?

Литература

• Chua N.-H., Schmidt G. W. Post-translational transport into intact chloroplasts of a precursor to the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase // PNAS. 1978. Vol. 75. P. 6110–6114.
• Highfield P. E., Ellis R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase // Nature. 1978. Vol. 271. P. 420–424.
• Bauer J. et al. The major protein import receptor of plastids is essential for chloroplast biogenesis // Nature. 2000. Vol. 403. P. 203–207.
• Kikuchi S. et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane // Science. 2013. Vol. 339. P. 571–574.
• Kikuchi S. et al. A Ycf2–FtsHi heteromeric AAA-ATPase complex is required for chloroplast protein import // The Plant Cell. 2018. Vol. 30. P. 2677–2703.
• Ling Q. et al. Ubiquitin-dependent chloroplast-associated protein degradation in plants // Science. 2019. Vol. 363. Art. eaav4467.
• Jin Z. et al. Structure of a TOC-TIC supercomplex spanning two chloroplast envelope membranes // Cell. 2022. Vol. 185. P. 4788–4800.
• Liu H. et al. Architecture of chloroplast TOC–TIC translocon supercomplex // Nature. 2023. Vol. 615. P. 349–357.
• Liang K. et al. Structural insights into the chloroplast protein import in land plants // Cell. 2024. Vol. 187. P. 5651–5664.
• Liang K. et al. Conservation and specialization of the Ycf2-FtsHi chloroplast protein import motor in green algae // Cell. 2024. Vol. 187. P. 5638–5650.
• Bölter B., Soll J. Ycf1/Tic214 is not essential for the accumulation of plastid proteins // Molecular Plant. 2017. Vol. 10. P. 219–221.